生物技术制药课件

生物技术制药（Biotechnological

Pharmaceutics）第一章 绪

论Chapter

1

Introduction第一节

生物技术的发展史Section

1Development

history

ofbiotechnology一、生物技术（Biotechnology）（一）定义以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有

预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合

进行加工生产，为社会提供商品和服务的综合

性技术体系。（二）生物技术的范畴基因工程

核心和关键、主导技术细胞工程

基础酶工程

条件发酵工程

产品获得手段生化工程

分离、纯化、衍生……第二代“基因工程”第二/第三代“蛋白质工程”第三代“生物技术”（海洋生物技）……（三）生物技术相关学科生物学（微生物、分子生物、遗传……）化学（生物化学、蛋白质化学……）工程学：（化学工程、电子工程……）医学药学农学生物技术的基础学科与分支分子生物学医药生物技术微生物学生物技术疫苗生物化学现代生物技术生物技术诊断遗传学农业生物技术细胞生物学家畜生物技术化学工程海洋生物技术二、生物技术的发展简史传统、近代、现代 三个阶段1、传统生物技术阶段→20世纪30年代简单酿造技术→微生物工业发酵

生产过程简单，大多属嫌气发酵或表面培养，生产设备要求不高，产品的化学结构简单，属微生物的初级代谢产物。特点:自然发酵、全凭经验公元前6000年古代巴比伦人酿造啤酒公元前4000年埃及人发酵面包殷朝制酱周朝制醋

1860年荷兰微生物学家安东.列文虎发明显微镜发现了微生物1865年法国科学家巴斯德证明了发酵原理1928年英国Fleming

发现青霉素2、近代生物技术阶段20世纪40年代→1953年微生物发酵技术是近代生物技术的基础技术

产品类型多，生物技术要求高，生产设备规模巨大，技术发展速度快1940年英国Florey、Chain

分离出青霉素3、现代生物技术阶段

1953年Watson

和Crick

提出DNA双螺旋结构模型；

基因重组技术、单克隆技术、动/植物细胞培养技术等；

是正在发展中的以DNA重组技术为核心的高技术综合体系，是当今国际优先发展的高技术领域之一。1953年Watson、Crick提出DNA双螺旋结构

1973年建立DNA重组技术1975年建立单克隆抗体技术1978年大肠杆菌表达出胰岛素1988年PCR方法1997年英国克隆多利羊1998年美国批准艾滋病疫苗进行人体实验2000年绘制出人类基因组草图……现代生物技术的内容1、重组DNA技术及其它转基因技术；2、细胞和原生质体融合技术；3、酶或细胞的固定化技术；4、植物脱毒和快速繁殖技术；5、动、植物细胞的大量培养技术；6、动物胚胎工程技术；7、现代微生物发酵技术（高密度、连续和其它新型发酵技术）；8、现代生物反应工程和分离工程技术；9、蛋白质工程技术；10、海洋生物技术，等等。现代生物技术的发展趋势1、基因操作技术日新月异，不断完善；2、新技术、新方法产生后被迅速应用；3、基因工程药物和疫苗的研究和开发突飞猛进；4、新的生物治疗制剂产业化前景十分光明5、转基因植物、动物取得重大突破；6、新的生物技术将给农业生产带来新的飞跃；7、生物体基因组及蛋白质结构与功能是研究的热点与重点；8、基因治疗取得重大进展，可能革新预防治疗领域；9、蛋白质工程10、生物信息学第二节

生物技术药物Section

2Biotechnological

drugs一、概念1、生物药物（biological

drugs）

指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品。2、生物技术药物（biotechnological

drugs）

采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。二、生物技术药物的分类（一）按来源分类1、应用重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类药物；2、基因药物（基因治疗剂、基因疫苗、反义药物、核酶等）；3、来自动物、植物和微生物的天然生物药物；4、合成与部分合成的生物药物。（二）按功能与用途分类

1、治疗药物2、预防药物3、诊断药物三、生物技术药物的特性1、分子结构复杂2、具有种属特异性3、治疗针对性强，疗效高4、稳定性差5、基因稳定性6、免疫原性7、体内半衰期短8、受体效应9、多效性与网络性效应10、检验的特殊性第三节生物技术制药Section

3Biotechnological

pharmaceutics一、定义生物技术制药（biotechnological

pharmaceutics）

采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。二、生物技术制药的特征1、高技术2、高投入3、长周期4、高风险5、高效益医药生物技术是整个生物技术领域中最为活跃的部分，将成为世界经济的支柱产业之一。1、基因工程药物；2、基因治疗；3、诊断试剂、酶制剂；4、动、植物医药产品；5、核酸类药物；6、利用现代生物技术改造传统生物药物。三、生物技术在制药中的应用基因工程制药细胞工程制药酶工程制药发酵工程制药途

径1、用克隆的基因表达生产有用的肽类和蛋白质类药物或疫苗；2、利用基因工程技术改造传统的制药工业基因工程制药内

容1、基因工程药物品种的开发基

2、基因工程疫苗因

3、基因工程抗体工

4、基因诊断与基因治疗程 5、应用基因工程技术建立新药筛选模型制 6、应用基因工程技术改良菌种产生新的微药 生物药物7、应用基因工程技术改进药物生产工艺8、利用转基因动、植物生产蛋白质类药物单克隆抗体技术动物细胞培养植物细胞培养生产次生代谢产物细胞工程制药1、利用酶或细胞、细胞器具有的催化功能2、酶的固定化技术、流化床反应器3、完成一般化学合成难以进行的反应4、微生物转化酶工程制药工艺改进新药研制菌种改造发酵工程制药四、医药生物技术的新进展医药生物技术产业化、商品化成高新技术产业之一。高投入、高风险、高利润,利润率达17.6%2000年全世界销售额1490亿美元，2005年超过3000亿美元。1、基础研究不断深入：CloneHuman

Genome

ProjectStem

Cell，et

al2、新产品不断出现：基因工程疫苗、细胞因子、蛋白质类药物等3、新试剂、新技术不断出现：Gene

Therapy，McAb，PCR4、新型生物反应器和新分离技术不断出现：酶和细胞的固定化、流化床式反应器五、我国的生物医药技术在较短时间内得到快速发展，取得明显成果；

差距相当大（创新性、自主开发新品种、上/下游关系、产业化进展）。第一节

概述自20世界70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。1982年第一个基因重组产品——人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近50种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。基因工程生产的活性蛋白与多肽免疫性蛋白：各种抗原和单克隆抗体细胞因子：INF、IL、CSF、EGF、凝血因子激素：胰岛素、生长激素、心钠素酶类：尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶基因工程技术生产药品的优点生产以往难以获得的生理活性蛋白和多肽提供足够数量的生理活性物质进行深入研究和扩大应用开发更多的内源性生理活性物质改造内源性生理活性物质作为药物的不足可获得新型化合物，扩大药物筛选来源第二节基因工程药物生产的基本过程基本原理将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术——基因工程技术获组构培产除半成包得建建养物菌成品装目重基工分过品检的组因程离滤检定基质工菌纯定因粒程化菌或细胞上

游 下

游上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。上游阶段在实验室完成。下游阶段：将实验室成果产业化、商品化。主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度纯品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制等。（优化发酵工艺、提高和保证产品质量）第三节目的基因的获得

应用基因工程生产药物，首先必须构建一个特定的目的基因无性繁殖系（即产生各种新药的、不同的基因工程菌株）。

来源于真核细胞的目的基因不能直接分离得到，只能拷贝DNA的很小一部分（10-5-10-7）。

真核基因一般都有内含子。原核细胞表达时缺乏

mRNA转录后加工系统，mRNA不成熟，即不能直接克隆真核基因。克隆真核基因方法：逆转录法、化学合成法真核基因克隆方法一、逆转录法——原理分离纯化目的基因——mRNA模板-1单链cDNA双链cDNAmRNA的互补DNA模板-2含表达信息逆转录酶逆转录酶DNA-SI

逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。1、mRNA的纯化

mRNA的特点：3’末端含有一多聚腺苷酸（polyA）组成的末端，能吸附于寡聚脱氧腺苷酸（dT）纤维素柱上。方法：亲和层析法2、cDNA第一链的合成

一般

mRNA都带有3’－polyA，所以可以用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的

化下，开始cDNA链的合成。用放射性探针法检测。

3、cDNA第二链的合成以cDNA第一链为模板合成第二链。4、cDNA克隆

用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA和噬菌体。又将其分为表达型载体和非表达型载体。

选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法：加同聚尾连接：在载体和cDNA的3’-末端加上互补的同型多聚酶序列。人工接头连接：所谓人工接头是指用人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断。5、将重组体导入宿主细胞6、cDNA文库的鉴定7、目的cDNA克隆的分离和鉴定核酸探针杂交法免疫反应鉴定法◆真核基因克隆方法逆转录法——过程mRNA的纯化cDNA第一链cDNA第二链导入宿主细胞cDNA文库鉴定目的cDNA克隆的分离鉴定dT-纤维素柱吸附dNTP*质粒DNA(pUC/pBR322)噬菌体DNA(λgt10/λgt11)cDNA克隆核酸探针杂交法免疫反应鉴定法二、逆转录－聚合酶反应法该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链，

不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。三、化学合成法1、化学合成法——前提条件知道目的基因的核苷酸排列顺序知道目的蛋白质的氨基酸顺序

2、化学合成法——不足不能合成太长的基因选择密码子困难费用高四、筛选基因的新方法编码序列富集法岛屿获救PCR

法动物杂交法功能克隆法构建cDNA

文库差异显示技术的应用编码序列富集法

利用磁力对cDNA文库中的目的基因进行富集的技术。

质粒DNA库→酶切后连上接头→5’端用生物素标记的与接头序列相同的引物进行PCR扩增→cDNA文库的插入片段同法扩增→杂交得到带有生物素的DNA双链→加含有磁珠核心的链霉抗生素蛋白→DNA双链结合磁珠→外磁场下，目的基因与其他DNA片段分离。岛屿获救PCR法

直接从已测序的基因组DNA上寻找杓码序列，经计算机分析找出开放阅读框，用外显子陷阱法和寻找CpG岛的方法克隆编码基因。动物杂交法

利用已知序列的其他物种的基因从构建的人基因组文库或cDNA文库中将目的基因调出。如同源性高的基因、基因家族成员间的序列相似性等。功能克隆法依赖基因表达产物和生物学功能的基因克隆法。

可采用基因敲除术、RNA干扰术、酵母双杂交技术、高通量表达技术、流式细胞术等手段，从基因水平、表达调控水平、蛋白质水平、细胞水平获得基因功能信息。构建cDNA文库

通过表达序列标签（EST）进行基因作图和基因组序列中编码序列的鉴别，用PCR技术扩增基因组中的特异片段。差异显示技术的应用

利用mRNA差异显示技术、减数PCR技术、差减杂交技术等寻找

新基因。如通过正常组织与肿瘤组织某些基因和蛋白质的差异表达，寻找在肿瘤细胞中高表达基因或沉默基因，推测其是癌基因或抑癌基因。五、对已发现基因的改造

对基因的功能相关区域研究，采用基因修饰技术和点突变技术进行基因新功能研究和再确证，从而提高目的基因表达产物的稳定性和体内半衰期，提高表达产物的生物学活性，降低有效使用剂量或提高表达量，降低毒性或免疫原性。第四节

基因表达

基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。

基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片断，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。关键问题——建立最佳的基因表达体系目的基因的表达产量表达产物的稳定性表达产物的生物学活性表达产物的分离纯化一、宿主细胞的选择选择宿主细胞的条件

1）易获得较高的浓度能利用易得价廉原料不致病、不产生内毒素发热低、需氧少、发酵温度/细胞形态适当易进行代谢调控易进行DNA重组技术操作产物的产量、产率高，易提取纯化宿主细胞分类原核细胞大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等真核细胞酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等[原核细胞]大肠杆菌***高效、表达产物形式多样、杂质多胞内表达为主，提取困难（破碎细胞）分泌不足，需在下游经变性/复性处理无修饰作用，不能糖基化，应用受限制（5）N-端含甲硫氨酸残基，易致免疫反应（6）产生内毒素、蛋白酶等枯草芽孢杆菌分泌能力强不能糖基化胞外蛋白酶强链霉菌不致病、安全分泌能力强有糖基化能力变铅青链霉菌限制修饰能力弱（理想）[真核细胞]酵母（酿酒）***基因组小、易调控、高效繁殖迅速、价廉、无毒分泌能力强能糖基化丝状真菌种类多（＞30）、易得、安全分泌能力强能正确进行翻译后加工（剪切/糖化）糖化程度高哺乳动物细胞能分泌、易调控、易纯化糖基化产物，接近天然生产慢、产率低培养条件苛刻、费用高二、大肠杆菌中的基因表达表达载体必须具备的条件能独立复制（严紧型/松弛型）有灵活的克隆位点、筛选标记方便启动子强、易被RNA聚合酶识别有阻遏子，控制启动子在诱导时才转录终止子强，主要转录克隆的外源基因产生的mRNA有起始翻译信号（AUG与SD序列），转录后能顺利翻译pBV220系统、pET系统影响目的基因在大肠杆菌表达的因素外源基因的拷贝数外源基因的表达效率①启动子的强弱②核糖体结合位点的有效性③SD序列和起始密码AUG的距离④密码子组成表达产物的稳定性——减少降解①组建融合基因②利用信号肽转移产物③位点特异突变而改变蛋白S-S位置④选用蛋白酶缺陷型菌株细胞的代谢负荷（二阶段培养）工程菌的培养条件真核基因在大肠杆菌中的表达形式融合蛋白形式：由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质。N-原核序列—C-真核序列非融合蛋白形式启动子-SD序列-起始密码子-结构基因-终止密码分泌型三、酵母中的基因表达酵母表达系统载体载体的复制序列YEp（酵母附加体质粒）YRp（酵母复制型质粒）YCp（酵母着丝粒质粒）YIp（酵母整合型质粒）克隆载体：由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易，所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的。表达载体：普通/精确影响目的基因在酵母菌中表达的因素外源基因的拷贝数外源基因的表达效率启动子/分泌信号的效率/终止序列的影响外源蛋白的糖基化宿主菌株的影响菌体生长力强、内源蛋白酶弱、菌株性能稳定、分泌能力强四、动物细胞中的基因表达表达体系产

物产生部位培养方式提

纯产物活性危

险大肠杆菌多肽蛋白质融合蛋白菌体内容易部分高产一般原核好真核差不大酵母多肽蛋白质糖化蛋白菌体内分泌出细胞容易可高产菌体内稍复杂真核接近天然不大哺乳动物细胞完整糖基化蛋白分泌出细胞难可高产成本高简单天然致癌性第五节基因工程菌生长代谢的特点菌体生长速度反映蛋白质的合成速度

控制菌体生长可提高质粒稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源性蛋白产率能量的供应决定菌体的最大比生长速率

小分子前体和催化组分的限制决定菌体的最大比生长速度要

点一、菌体生长与能量的关系菌体生长由呼吸控制，碳源通过有限的呼吸能力所能提供最大能量决定菌体在该培养基的最大比生长速率。菌体生长所需能量大于有氧代谢所能提供的能量时，菌体产生的代谢副产物乙酸能抑制菌体的生长，尤其在高密度培养时，提高培养基pH可减弱乙酸的作用。（3）分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释

速率等，通过降低供能速度和前体供应

速度来控制菌体的糖酵解速度，使之低

于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，减少乙酸产生和抑制，在一定范围能控制菌体生长，实现高密度培养和提高产物的表达水平。一、菌体生长与能量的关系实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度。二、菌体生长与前体供应的关系培养基中加入氨基酸能提高菌体比生长速率，使蛋白合成增加。菌体中小分子前体量和催化结构有限，各个基因相互竞争共同的前体和催化结构限制了菌体的比生长速率。基因表达在各个水平的竞争又是各个基因互相竞争共同的前体和催化结构的结果。由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足，因而在同样的培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。在中等拷贝质粒（56）工程菌中，外源基因的复制、转录、翻译引起菌体内前体浓度的降低，可诱导与前体合成有关的酶相对水平增加（与宿主细胞比）。在高拷贝质粒（240）工程菌中，前体大量被利用而引起不足，产生“严紧反应”（ppGpp），核糖体及有关酶水平比宿主细胞低。

“严紧反应”：当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留，合并成被称为“魔点”的ppGpp的结果。第六节基因工程菌的不稳定性

基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，又分为分裂不稳定和结构不稳定。分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。一、质粒的不稳定性质粒不稳定产生的原因分裂不稳定、结构不稳定二种类型含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率两种菌的比生长速率差异的大小（质粒拷贝数低/高）质粒稳定性的分析将工程菌培养液样品适当稀释，在不含抗性标记的平板培养基培养10-12h，随机选100个菌落接种到含抗性标记的培养基培养10-12h，统计长出的菌落数，计算比值——ST（stability）二、提高质粒稳定性的方法选择合适的宿主菌宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等。选择合适的载体低拷贝质粒工程菌——不含质粒子代频数大高拷贝质粒工程菌——比生长速率低于不含质粒菌调控比生长素率可改变质粒拷贝数（3）两阶段培养法①使菌体生长至一定密度②诱导外源基因的表达在培养基加入选择性压力（加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长）控制培养条件（温度、pH、培养基组分、溶解氧浓度）固定化第七节基因工程菌中试中试应考虑的问题：适合商品化生产的工程菌设计发酵反应器选择反应过程发酵培养基组分维持生产工艺最佳化的方法工艺监测、控制、自动化使用方法生物催化剂的使用产品分离、纯化方法一、工程菌选择（条件）能用一般基因重组技术获得有高产潜力能以工业原料（碳源）为培养基生产工艺能用一般工业生产经验能产生、分泌蛋白质不致病、无毒性生产安全，符合国家卫生部门规定代谢能控制产品有特异性发酵液黏度小二、反应器（发酵罐）设计符合生物反应与化学工程的需要

设计前的生物数据：培养细胞系特性、细胞生长率、发酵罐消毒方法、温度、溶氧、pH、CO2、代谢产物、后处理效果等

设计要求：能连续发酵和分批发酵；附有加料管、取料管、测量仪表；易安装与移动；仪表数据可靠，重现性好；可任意装置附件；罐体为不锈钢、光滑。三、发酵培养基组成

提供化学元素：C、N、O、H、P、微量元素、金属离子等提供特殊营养：氨基酸、维生素等提供能源：葡萄糖等控制代谢：加入活性物质、改变温度和pH等四、工艺优化与参数监控

优化工艺：周期短、产量高、质量好、消耗低、安全性高、废物处理周全、速度快、失败率低等综合指标。监控数据：主要参数：pH、温度、溶氧、CO2生物量：浊度、细胞组分、总氮量、菌丝干重碳源：糖、有机酸、乙醇、淀粉、脂质产品五、计算机的应用优化生产工艺降低劳动强度自动化第八节重组工程菌的培养基因工程菌的培养过程摇瓶操作：了解工程菌生长的基础条件（温度、pH、培养基组分及C/N），分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响。培养罐操作：确定培养参数、控制方案及顺序。一、基因工程菌的培养方式补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。溶氧、流加补料（2）连续培养：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。两阶段连续培养，控制和优化诱导水平、稀释率、细胞比生长速率。（3）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养：维持质粒稳定性（5）分批培养

DO-Stat法：调节搅拌转速和通气速率控制溶氧在20%，补料的流加速率是关键。

Balanced

DO-Stat法：控制溶氧、搅拌转速、糖的流加速率，使乙酸维持在低浓度。

控制菌体比生长速率的方法：在最优表达水平获得高密度、高表达。二、基因工程菌的培养工艺基因工程菌发酵工艺的影响因素培养基的影响（C、N、无机盐、维生素、微量元素等）常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。（2）接种量的影响（取决于菌种在发酵中的生长繁殖速度）接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。（3）温度的影响（复制、转录、翻译、调节分子的合成）在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；在转录水平上，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；温度也可在mRNA讲解和翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达，也可通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表。温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。（4）溶解氧的影响（调节搅拌转速—前期低/后期高）溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。诱导时机的影响（温度、氧、营养）一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。pH的影响（细胞生长期、外蛋白表达期）pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。（7）诱导表达程序的影响：热诱导·

总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。基因工程菌的培养设备（P90，自学）第九节

高密度发酵（自学）第十节基因工程药物的分离纯化基因工程产品的特点（1）目的产物在初始物料中含量较低含目的产物的初始物料组成复杂目的产物的稳定性差，易失活/变性生物活性物质种类繁多应用面广，对质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等

因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素含目的产物的起始物料的特点①菌种类型及代谢特性②原材料和培养基的来源及质量③生产工艺与条件④初始物料的理化特性与生物学特性物料中杂质的种类和性质目的产物特性产品质量的要求二、分离纯化的基本过程

分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过4～5个步骤，包括细胞破碎、固液

分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品

以及成品加工。发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离细胞分离碎片包含体变性复性浓初高制产缩步度剂品分离纯化三、分离纯化技术分离纯化技术的要求技术条件温和，保持产物活性选择性好收率高技术能衔接，减少工艺步骤分离速度快，能满足高生产率要求三、分离纯化技术（1）——细胞破碎与固液分离细胞收集：离心法、膜过滤法细胞破碎：机械破碎法：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法非机械破碎法：酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法固液分离：离心、膜过滤、双水相分配三、分离纯化技术（2）——目的产物的分离纯化色谱分离方法离子交换色谱：正吸附、负吸附反相色谱与疏水色谱：亲和色谱：凝胶过滤色谱：

蛋白质纯化方法的设计通常根据产物分子的物理、化学参数和生物学特性。

选择纯化方法应根据目的蛋白质和杂蛋白的物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质的差异。三、分离纯化技术（2）——目的产物的分离纯化产物特性

作

用等电点

决定离子交换的种类与条件相对分子量

选择不同孔径及分离范围的介质疏水性

与疏水、反相介质结合的程度特殊反应性

产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制聚合性

是否采取预防聚合、解聚及分离除去聚合体生物特异性

决定亲和配基溶解性

决定分离体系及蛋白浓度稳定性

决定工艺采取的温度及流程时间微不均一性

影响产物的回收离子交换色谱（ion

exchange

chromatography,IEC）基本原理是通过带电的溶质分分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。

蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响其离子交换的性能，影响蛋白质离子交换色谱保留的其他因素，还有交换基团和交换介质的种类、吸附和洗脱的条件

等。（2）反相色谱（reversed

phase

chromatography,RPC）和疏水色谱（hydrophobic

interaction

chromatography,HIC）

反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。（3）亲和色谱（

affinity

chromatography,AC）

亲和色谱是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附的。亲和色谱的过程大致分为3步：第一步配基固定化;第二步吸附目的产物；第三步样品解吸。（4）凝胶过滤色谱

凝胶过滤是以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。三、分离纯化技术（3）——非蛋白类杂质的去除去除DNA、热源、病毒等方法离心/过滤阴离子交换阳离子交换超滤疏水层析凝胶过滤40nm微孔滤膜0.22μm微孔滤膜目

的去除细胞、碎片、颗粒性杂质（病毒）去除杂质蛋白、脂质、DNA、病毒去除牛血清蛋白或转铁蛋白去除沉淀物、病毒去除残余杂质蛋白与多聚体分离去除病毒除菌四、选择分离纯化方法的依据根据产物表达形式根据分离单元间的衔接根据分离纯化工艺的要求具有良好的稳定性和重复性尽可能减少组成工艺的步骤工艺步骤间相互适应、协调工艺过程中尽可能减少试剂工艺所用时间工艺技术必须高效、收率高、易操作、设备要求低具有较高安全性第十一节

变性蛋白的复性（自学）第十二节基因工程药物的质量控制一、医药生物技术产品质量保证的一般要求产品安全性评价产品本身的结构严格控制条件二、生物材料的质量控制1、原材料的质量控制

原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。目的基因、表达载体、宿主细胞2、培养过程的质量控制

在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。3、纯化工艺过程的质量控制

产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致；外源性蛋白质、DNA与热原都控制在规定限度下。4、目标产品的质量控制产品鉴别

肽图分析：肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。肽图分析结果与氨基酸成分和序列分析结果合并，作为蛋白质的精确鉴别。

氨基酸成分分析：对目的产物的纯度仍可以提供重要信息。

部分氨基酸序列分析：可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。

重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定：浓度

测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林－酚法和紫外光谱法等。相对分子质量测定最常用的方法有凝胶过滤法和SDS－PAGE法，凝胶过滤法是测定完整的蛋白质相对分子质量，而

SDS－PAGE法测定的是蛋白质亚基的相对分子质量。

蛋白质二硫键分析：方法有对氯汞苯甲酸法（p-chloromercuribenzoate,PCMB）和5,5’－二硫双基－2－硝基苯甲酸法（5,5’－dithiobis－2－nitrobenzoic

acid,DTNB）等。（2）纯度分析

纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两个方面的内容。

目的蛋白质含量测定：通常采用的方法有还原性及非还原性SDS－PAGE法、等电点聚焦、各种HLPC、毛细管电泳（CE）等。杂质：蛋白质、非蛋白质1）蛋白类杂质：主要的是纯化过程中残余的宿主

细蛋白。它的测定基本上是采用免疫分析的方法，其灵敏度可达百万分之一。同时需辅以电泳等其

他检测手段对其加以补充和验证。其他的蛋白杂

质也要严格控制。2）非蛋白质类杂质：主要有病毒和细菌等微生物、热原、热原质、内毒素、致敏原及DNA。（3）生物活性测定

需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。稳定性考察产品一致性保证

5、产品保存的质量控制液态（低温、稳定pH、高浓度、加保护剂）固态第一节概述细胞学说组织培养或细胞培养细胞工程细胞工程（Cell

engineering

or

cytotechnology）

以细胞为单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论与技术，按人们的意愿有目的地进行设计和操作，改变细胞的某些遗传特性，达到改良或产生新品种

的目的，或使细胞增加/重新获得产生特定产物的能力，在离体条件下进行大量培养、增殖，提取目的

产品。第一节概述基因工程/基因重组细胞融合细胞移植染色体改造转基因细胞培养产物的提取纯化等技术第二节动物细胞的形态和生理特点一、动物细胞的形态适应功能,形态各异离体培养细胞分三类： 贴壁细胞悬浮细胞兼性贴壁细胞第二节动物细胞的形态和生理特点1、贴壁细胞

生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。两种形态：成纤维细胞型上皮细胞型第二节动物细胞的形态和生理特点2、悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。3、兼性贴壁细胞生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。二、动物细胞的生理特点1、细胞的分裂周期长细胞分裂时间为12～48h，细胞的分裂周期=间期+分裂期间期（G1+S+G2）分裂期（M）G1期：4～6h，合成DNA聚合酶及RNA合成S期：6～8h，DNA合成G2期：2～5h，DNA量加倍,RNA合成M期：0.5～1h，染色体分裂细胞代数为细胞分裂次数传代数表示细胞培养分种传代次数细胞代数=传代数×分种数/2 X=(logN-logN0)÷log2X：代数N：培养最终细胞数

N0：培养起始细胞数倍增时间=培养经过时间÷代数第二节动物细胞的形态和生理特点2、细胞生长需贴附于基质，有接触抑制现象电荷、钙、镁、贴附因子（胶原、纤维结合蛋白等）接触抑制或密度依赖抑制（转化异倍体后此现象消失）第二节动物细胞的形态和生理特点3、正常二倍体细胞的生长寿命有限原代培养有限细胞系：种族、年龄无限细胞系或连续细胞系：异倍体第二节动物细胞的形态和生理特点4、动物细胞对周围环境十分敏感

理化因素如：渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等。5、动物细胞对培养基要求高必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体粗面内质网的核糖体游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。

粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白，多为糖蛋白。动物细胞生产药物优点：分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。缺点：培养条件高、成本贵、产量低。第三节生产用动物细胞的要求与获得一、生产用动物细胞的要求原代细胞二倍体细胞系转化细胞系二、生产用动物细胞的获得1、原代细胞

是直接取自动物组织器官经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。需要大量动物，费钱费劳力。鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。2、二倍体细胞系

原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。二倍体细胞有正常细胞的特点①染色体组型是2n

核型；②贴壁依赖接触抑制；③可传代培养50代；④无致瘤性。3、转化细胞系

通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。

转化过程可以是自发的、人工的、从动物肿瘤组织中建立。4、融合细胞系仙台病毒融合法聚二乙醇融合法电融合法第三节生产用动物细胞的要求与获得三、常用生产用动物细胞特性

1、WI-38

核型2n=46，成纤维细胞，能产生胶原，BME培养

基+10%小牛血清，pH=7.2，同功酶B型G-6-PD，倍增时间24h，有限寿命50代，安全，用于制备疫苗。2、MRC-5

从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。核型

2n=46，属成纤维细胞，42-46代，较WI-38增殖快，对环境敏感性较WI-38低，对病毒敏感，用于制备

疫苗。3、CHO-K1

从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。核型

2n=20-22，上皮样细胞，培养基加脯氨酸。用于构建缺乏FH2还原酶突变株，DMEM培养基+

次黄嘌呤+胸苷+10%小牛血清。4、BHK-21

从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为DMEM+7%胎牛

血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。5、Vero：

从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；

199+5%胎牛血清，增殖病毒（包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒）6、Namalwa

从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取，建成的人的类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率，12～14条标记染色体。单条X，无Y。培养基为RPMI

1640+7%胎牛

血清。用于生产α干扰素。7、SP2/0-Ag14

通过融合的方法从有羊抗红细胞活性的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合杂交瘤

SP2/NL-Ag亚克隆中分离获得，能耐受8氮鸟嘌呤

20μg/ml但在含HAT选择培养基中不能存活。

通常用培养基为DMEM+10%胎牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞和抗体。8、Sf-9

1983年从亲代IPLB—SF21AE中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。

通常用的培养基为Grace培养基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液,10%胎牛血清。用于高效表达外来蛋白制品。9、C127

RⅢ小鼠乳腺肿瘤细胞，适合带有牛乳头瘤病毒载体的转染后细胞形态发生显著变化。生产重组人生长激素。10、COS细胞

用复制起点缺失SV40的基因组DNA转化非洲绿猴肾细胞CV-1获得三个细胞系：COS-1、COS-3、COS-7广泛应用于瞬时表达系统。11、MDCK来源于成年雌性西班牙长耳狗的肾脏；贴壁型上皮细胞；支持多种病毒增殖；生产兽用疫苗。四、基因工程细胞构建和筛选

在生产中采用更多的更有前景的是融合细胞及采用基因工程构建的各种工程细胞。被用构建工程细胞的动物细胞有：CHO-dhfr、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9等细胞。1、真核细胞基因表达载体的构建使用的载体有两类：（一）病毒载体牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒（二）质粒载体：穿梭质粒载体牛痘病毒：用构建多价疫苗腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。杆状病毒：用于外源基因表达。杆状病毒作为载体的优点：①双链DNA，易重组②插入7～8kb

DNA不影响正常病毒粒子的形成。③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%～30%；⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克隆。⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因。质粒载体

在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分：①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。②含有使基因表达的调控元件。③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选基因载体导动物细胞常用方法是： 磷酸钙沉淀法电穿孔法磷酸钙沉淀法：

溶解的DNA

加Na2HPO4和CaCl2

形成磷酸钙沉淀，

DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉

淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。电穿孔法：

借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。五、细胞库的建立生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：⒈原始细胞库⒉生产用细胞库原始细胞库贮存时须有该细胞的详细挡案，包括：①该细胞系的历史②该细胞系的特性③对各种有害因子的检查结果生产用细胞库

从原始细胞库来的，或从单一安瓿来，或从多个安瓿来即刻混合，经培养扩增再分装储存形成细胞库。需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染的检查。需确定最高使用的传代数。第四节动物细胞的培养条件与培养基细胞体外培养基本条件:①无菌②营养充足，防止有害物质③氧气④随时清除代谢有害物质⑤良好的生存外环境⑥及时分种一、动物细胞的培养条件

1、器材的清洗和消毒浸泡、刷洗、泡酸、冲洗组

分 强酸 次强酸 弱酸重铬酸钾/g

63

120100硫酸/ml水/ml100020020010001001000器材的消毒灭菌：物理、化学、抗生素

2、水质3、pH：7.2-7.4,缓冲系统4、 透压:290-300mOsm/kg，1mg/ml

NaCl

→

32mOsm/kg，平衡盐溶液（BBS）5、温度：37±0.50C6、空气：＜30%二、动物细胞的培养基的种类和组成⒈天然培养基⒉合成培养基⒊无血清培养基⒈天然培养基血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳定⒉合成培养基DME、MEM、DMEM、HAM

F12、RPMI1640、ISOCOV、199、McCoy

5A合成培养基组成成分⑴氨基酸⑵维生素⑶糖类⑷无机盐⑸其它成分添加小牛血清：5%-10%提供生长因子和激素提供贴附因子和伸展因子提供结合蛋白提供必需脂肪酸和微量元素提供合适的pH缓冲系统⒊无血清培养基①提高重复性②减少微生物污染③供应充足、稳定④产品易纯化⑤避免血清因素对细胞的毒性⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰无血清培养基加入添加剂⑴生长因子和激素⑵结合蛋白⑶贴附因子和伸展因子⑷有利细胞生长的因子和元素第五节

动物细胞培养方法和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法依细胞种类:原代培养、传代培养依培养基:液体培养、固体培养依培养器和方式:静止培养、旋转培养、

搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养从生产实际分为: 悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养⒈悬浮培养让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖。⒉贴壁培养让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。⒊贴壁-悬浮培养⒊贴壁-悬浮培养⑴微载体培养⑵包埋和微囊培养⑶结团培养1、悬浮培养适合非贴壁依赖细胞、兼性贴壁细胞

操作简便、培养条件均一、传质和传氧较好、易扩大培养规模细胞体积小、难采用灌流培养、细胞密度低通气搅拌罐式与气升式生物反应器2、贴壁培养适合贴壁细胞、兼性贴壁细胞优/缺点与悬浮培养相反

在传代或扩大培养时需要酶将细胞从基质上消化下来（胰酶、二乙烯四乙酸钠/EDTA、胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶、链霉蛋白酶、木瓜酶等）3、贴壁-悬浮培养微载体培养扩大贴附面积、保持悬浮状态葡聚糖类、聚苯乙烯类、胶原类理想微载体：表面性质与细胞相容性好，适合附着、伸展、增殖材料无毒性惰性材料，不与培养基反应、不吸收营养比重1.030-1.045g/ml，搅拌悬浮、静止沉降溶胀后粒径60-250μm，差异不大于20μm光学透明性好基质软性，减少搅拌时损伤细胞可耐1200C高温经简单处理后可反复使用原料充分、制作简便、价廉多孔微载体/多孔微球增大比表面积加钛等金属，增加比重，适合流化床反应器不含钛等，比重轻，适合搅拌/气升式反应器（2）包埋和微囊培养人工合成高分子聚合物、糖类、蛋白质琼脂糖、海藻酸钙凝胶最常用温度、离子移变改变物相

保护细胞，避免损害；可获得较高密度；控制微囊粒径可浓缩产品，利于纯化；可用多种反应器大规模培养（3）结团培养细胞作基质相互贴附，悬浮培养

微粒用量小，细胞不能在载体上伸展，呈球形，操作简便，节约微载体成本二、动物细胞培养的操作方式⒈分批式操作⒉半连续式操作⒊灌流式操作第六节动物细胞生物反应器及检测控制系统一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构⒈搅拌式生物反应器⒉气升式生物反应器⒊中空纤维式生物反应器⒋透析袋或膜式生物反应器⒌固定床或流化床式生物反应器搅拌式生物反应器气升式生物反应器中空纤维式生物反应器平床式中空纤维式生物反应器透析袋或膜式生物反应器固定床或流化床式生物反应器Celligen

plus生物反应器二、动物细胞生物反应器的检测控制系统⒈培养过程需检测的物化参数直接在线检出取样离线检测检测后计算⒉主要参数的检测和控制方法培养过程需检测的物化参数温度、pH、搅拌速度、溶氧；活细胞数、氨基酸浓度、葡萄糖、乳酸、铵离子；

细胞群体倍增时间、细胞比增长率、葡萄糖消耗量、乳酸产率、反应器的生产率等主要参数的检测和控制方法⑴温度⑵

pH①在培养初期，控制进氧量②当细胞密度提高后控制NaHCO3的量⑶溶氧⑷搅拌⑸进出液流量⑹其它第七节动物细胞产品的纯化方法与质量要求（自学）第八节

动物细胞制药的前景与展望提高产量降低成本和改进质量方面的研究转基因动物的研究组织工程的研究提高产量、降低成本和改进质量为了提高产量,要提高细胞表达水平。为降低成本，须改进培养基配方。为改进产品质量，关键是糖基化质量。改进工艺，生产设备等转基因动物的研究

自1982年Palimiter提出用转基因动物来生产药用蛋白以来，发展迅速。优点：产量高成本低质量与天然一样。现还有不成熟之处。对动物和人的健康的影响。组织工程的研究

组织工程：通过对大量细胞的培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如人造皮肤、人造肝脏、人造胰腺、人造血管、人造骨等并用于临床治疗。第一节

概述

1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开创了抗体制药。1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白，α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。第一节

概述抗体（antibody,Ab）是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。即B细胞→浆细胞→球蛋白（1）抗体与免疫球蛋白

20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类

似的球蛋白，统称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。

所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念。（2）多克隆抗体与单克隆抗体

多克隆抗体（polyclonal

antiboty,PcAb）：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。

1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonal

antibodyMcAb）。

单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的发展。单克隆抗体的应用：

单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用于疾病的诊断和治疗。

单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。

单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。

以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。免疫导向疗法的障碍与改造鼠源性、分子量大降低免疫源性、降低分子量第二节单克隆抗体

单克隆抗体：将抗体产生细胞（B淋巴细胞）与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的抗体。

针对一个抗原决定簇、单一B细胞克隆产生、结构和特异性完全相同、高纯度。抗

原小鼠/大鼠脾

脏B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞多克隆单克隆第二节单克隆抗体——抗原与动物免疫1、制备抗原→动物免疫

制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。有的抗原可以用化学合成：地高辛2、抗原的制备与纯化多数抗原物为混合物，须经免疫、筛选、克隆化。

3、免疫动物品系与骨髓瘤细胞品系骨髓瘤细胞来源：BALB/c小鼠、Lou大鼠

骨髓瘤细胞系

全

名

简称

来源耐受表达自身Ig分子p3-X63-Ag8MOPC11-X45-6TGX63

BALB/cX45

BALB/c8-Ag6-TGIg-r1.κIg-r2bp3-NS1-Ag4.1NS-1

BALB/c8-Agκ（非分泌型）p3-X63-Ag8.653P3.653

BALB/c8-Ag——SP2/0-Ag14SP2/0

BALB/c8-Ag——Fast-ZeroFO

BLAB/c8-Ag——Y3-Ag1,2,3Y3

Lou8-Agκ链YB2-3.0-Ag20YB2

(LouAO)F18-Ag——免疫方法：体内、体外1、体内免疫法：适合免疫性强、抗原量较多、8-12周龄雌鼠。颗粒性抗原：S.C

107个细胞初次免疫，1-3W免疫

1-2次；可溶性抗原：10-100μg（Ag）+等量福氏完全佐剂（S.C），2-4W/1-2次（不加佐剂）采集脾细胞前3d

iv最后一次抗原（刺激B细胞分裂）脾内免疫法：Ag

0.1-0.2ml，105/10μg（追加免疫）2、体外免疫：不能用体内方法或抗原免疫原性极弱且引起免疫抑制时。

抗原量少（＜10μg）、免疫期短（4-5d）、干扰因素少、杂交瘤细胞株不稳定。

4-8W

BALB/c小鼠脾脏制成细胞悬液，加Ag达0.5-5μg/ml，培养4-5d（370C、5%CO2），分离脾细胞，细胞融合。淋巴细胞（致敏动物脾细胞）骨髓瘤细胞（腹水癌型浆细胞）培养液含单克隆抗体BALB/c小鼠腹水中含单克隆抗体融合处理选择融合细胞培养杂交瘤细胞杂交瘤细胞克隆化第二节单克隆抗体——细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养1×108骨髓瘤细胞2×107～3×107DMSO①PEG：40%-50%4000，2min②脾细胞③+培养液稀释PEG融合率高自身不分泌抗体杂交瘤细胞分泌抗体强而稳定HAT/7d脾——脾

脾——瘤

瘤——瘤

瘤细胞×××HT/7-14dRPMI1640抗体阳性检测（8-9天）小鼠腹腔巨噬细胞脾细胞胸腺细胞HAT培养液RPMI1640培养液成分浓度成分含量H1.0×10-4mol/LRPMI1640粉10.4gA4.0×10-7mol/LHEPES2.4gT1.6×10-5mol/LL-谷氨酰胺0.3g青霉素、链霉素各10万U水

1000mlpH=7.4，过滤、除菌H（次黄嘌呤）A(氨甲喋呤，阻断DNA合成)T(胸腺嘧啶)第二节单克隆抗体——筛选阳性克隆与克隆化1、筛选免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术2、克隆化：是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。有限稀释法：HT培养液/饲养细胞软琼脂法：0.5%琼脂糖凝胶/易成功第二节单克隆抗体——杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定1、染色体分析：是鉴定的客观指标，了解分泌抗体的能力。数目多、集中（稳定高效价）2、McAb的Ig类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。3、亲和力测定4、特异性、纯度、识别抗原的相对分子量等第二节单克隆抗体——McAb的大量制备体内培养法：5-20mg/ml（1）1-2W前BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷（pristane）（2）7-12d抽腹水，离心，保留上清体外培养法：10μg/ml

（RPMT1640液培养）（1）加10%-20%胎牛或小牛血清（

100μg/ml

）（2）无血清培养：白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等（3）悬浮培养（2×107）（

400μg/ml

）与微载体悬浮培养（108）第二节单克隆抗体——McAb的纯化确定McAb的Ig类型和亚型

体外诊断试剂：IgG（沉淀+亲和层析）、IgM（沉淀+凝胶过滤）

体内诊断试剂或治疗用药：去除内毒素、病毒、核酸等（亲和层析、离子交换层析等）第二节单克隆抗体——McAb的纯化1、澄清和沉淀处理1000g/5min（除沉淀物）20000g/30min（小颗粒）0.2μm滤膜（除细菌等）饱和硫酸胺沉淀抗体50%饱和硫酸胺回收抗体2、分离

凝胶过滤：Sephadex

G200为介质，最高峰IgM，另两峰IgG，收率50-80%，纯度90%以上。

阴离子交换：IgG类，pH5.5除杂蛋白，pH7.4时IgG1、IgG2结合于层析柱，低离子强度IgG2a洗脱，

IgG2b、IgG3沉淀。

亲和层析：IgG类，pH8.0（IgG2b、IgG3结合在蛋白

A柱，IgG1稍差），pH3.5洗脱IgG2b，pH4.0洗脱

IgG3，pH4.5洗脱IgG2a，pH6.0洗脱IgG1。

总之，应依据单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。体内诱生法单克隆抗体的纯化方法：1、离心（取上清）、超滤、盐析2、分离⑴凝胶过滤（IgG、IgM单抗纯化）⑵阴离子交换层析（IgG单抗纯化）⑶亲和层析（IgG单抗纯化）第三节鼠源性单克隆抗体的改造

杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用，必须对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。

目的：降低免疫源性；降低相对分子量，增加组织通透性。人-鼠嵌合抗体、改形抗体、小分子抗体。基本结构人IgC-小鼠IgV相对分子量150000类型人-鼠嵌合抗体改形抗体FabFV单链抗体（SCFV）单域抗体小鼠CDRs替换人CDRs完整L链和FdVH和VLVH-多肽-VLVH或VL最小识别单位（MRU）一个CDR15000050000250002700012500＜2000一、人-鼠嵌合抗体抗原抗体结合功能—抗体可变区（V）同种性免疫源性—抗体稳定区（C）

在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。二、改形抗体（CDR移植抗体）

Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。

H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性，可消除免疫源性。

将鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig的CDR序列——CDR移植抗体

用与鼠对应部分有较大同源性的人框架区替换鼠框架区——模板替换

对鼠CDR及框架区表面残基进行镶饰或重塑——表面重塑

改变人框架区与CDR有相互作用、与抗体亲和力有关或对框架区空间结构起关键作用的残基——补偿替换

保留鼠源性抗体可变区中参与抗原结合的残基，或CDR与框架区中的关键残基——定位保留三、小分子抗体基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的

V区片段，相对分子量为原抗体的1/80～1/3。即保留CDR区，而Ig分子中的C区不表达。小分子抗体类型有：①Fab片段抗体；②Fv抗体；③单链抗体；④单域抗体；⑤最小识别单位单链抗体的优点：①可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。②易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度。③相对分子量小，免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应，能延长T1/2。单链抗体•大的多在表大达肠杆：菌中表达，有三种形式：①直接在细胞质中表达；②与其它菌体融合表达融合蛋白；③分泌表达具有功能的单链抗体。四、双功能抗体：

即双特性抗体，是一种非天然性抗体。其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。构建方法化学交联法生物学方法（杂种-杂交瘤）基因工程方法：避免化学交联对抗体的损害、定向结合抗原部位、减少非特异分布与副作用五、抗•属体双融功合能抗蛋体白范畴配基-配基型融合蛋白（CD4-Fcγ）配基-Ig型嵌合蛋白（IL-2-Ig）配基-FV型嵌合蛋白（CD4-FVCD3）受体-FV型融合蛋白酶-抗体型融合蛋白（ADEPT）构建抗体融合蛋白的基本原则将第一个蛋白终止密码子删除，接上带有密码子的第二个蛋白基因，即实现两个基因共同表达。关键是两个蛋白的接头序列Linker

将第抗四体基节因基的克因隆工和程表达抗融体为和一抗体，体在工同程一载体上进行，抗体基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，选出阳性克隆，构建大库容文库（108），包括天然全套抗体基因，用基因工程方法研制任何一种具有高度特异性的抗体。抗体研究进展的3个阶段：①1890年白喉抗毒素，多克隆抗体；②1975年杂交瘤技术，单克隆抗体；③1994年基因工程抗体；一、噬菌体抗体库技术的基本方法获取目的基因：抗体某一特定基因区段（如VH、

VL可变区基因）抗体库技术的载体：噬菌粒载体（pHEN1）淘筛：抗原固相—噬菌粒群吸附、洗涤、洗脱—再感染扩增—大容量次级文库（反复进行）—淘汰非目的克隆，扩增目的克隆表达与鉴定：目的克隆导入感受态菌株二、噬菌体抗体库技术的特点模拟天然全套抗体库（外源基因来自人外周血、骨髓、脾脏淋巴细胞）避开人工免疫和杂交瘤技术可获得高亲和力的人源化抗体三、基因工程抗体的表达原核细胞表达真核细胞表达转基因植物表达转基因动物表达第五节抗体诊断试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂1、鉴定病原菌的抗体试剂⑴常用诊断血清的品种和用途①沙门氏菌属诊断血清②志贺氏菌属诊断血清③病原性大肠埃希氏菌诊断血清⑵诊断血清的制备步骤①制备细菌抗原②免疫动物和制备抗体血清⑶诊断血清诊断方法⒉乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂⒊妊娠诊断试剂⒋抗ABO血型系统血清⒈荧光抗体诊断试剂二、免疫标记技术用抗体类试剂⑴荧光抗体的制备⑵免疫荧光测定方法⒉免疫酶抗体诊断试剂⑴免疫酶染色法用抗体诊断试剂⑵酶免疫测定用抗体诊断试剂①HBsAg酶标诊断试剂②HBeAg酶标诊断试剂③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊断试剂④测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标抗体诊断试剂⑤甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊断试剂⑥癌胚抗原（CEA）的酶标抗体诊断试剂放射免疫用抗体诊断试剂

放射免疫技术是将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技术。放射性核素标记抗体的方法：①氯胺-T法②Iodogen氏法抗原的测定有：①夹心法②间接法③竟争法常用标记抗体试剂有①HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂②HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂③HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂④AFP放射性核素标记抗体诊断试剂⑤CEA放射性核素标记抗体诊断试剂三、•导放射向性诊核断素标药记物抗体肿瘤放射免疫显像定位技术（放免显像定