药品质量控制中的现代分析方法与技术课件

第二十一章药品质量控制中的现代分析方法的进展第二十一章药品质量控制中的现代分析方法的进展1

现代分析方法与技术，为药学的发展提供了适时而有效的辅佐与动力。 色谱及其联用技术：

药学研究－－分子水平。手性分析：毛细管电泳及手性色谱技术－－药物研究与质量控制提供了保障。现代光谱技术：药物结构鉴定，微量杂质检定。概况现代分析方法与技术，为药学的发展提供了适时而2

一、定义

电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）以此对物质进行分离分析的方法即电泳法第一节毛细管电泳及其应用一、定义第一节毛细管电泳及其应用3

二、发展简史

电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Reŭss进行了世界上第一次电泳实验）。但毛细管电泳技术最早是由瑞典科学家Hjerten提出的，其广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。国内最早是由竺安教授在1980年提出来的，他先后在中国科学院化学研究所和浙江大学建立了两个研究组。1992年CE开始受到国内广泛重视，发展很快。

4三.毛细管电泳的优点1、高灵敏度2、高分辨3、速度快4、进样少5、成本低高灵敏度：紫外检测器的检测极限在10-13—10-15mol之间，荧光检测可达10-19—10-21mol高分辨：峰分离效率超过1百万理论塔板数，一般可达几十万。速度快：许多分析在几秒至30分钟内完成。进样少：一般需要毫微升的进样量。成本低：一般只需要可长期使用的毛细管和极微量的可自己配制的缓冲液。三.毛细管电泳的优点1、高灵敏度高灵敏度：紫外检测器的检测5分离模式：（一）毛细管区带电泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。

正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；

阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流>ν电泳,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。

最基本、应用广的分离模式；分离模式：（一）毛细管区带电泳

capillaryzone6

1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。（二）胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）

micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC在电场力的作用下，胶束在柱中移动。1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓72.电泳流和电渗流的方向相反，

且ν电渗流>ν电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；5.色谱与电泳分离模式的结合。3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；2.电泳流和电渗流的方向相反，5.色谱与8（三）毛细管凝胶电泳（capillarygelelectrophoresis,CGE)（四）毛细管等速电泳（capillaryisotachor-phoresis,CITP)（五）毛细管等电聚焦电泳（capillaryisoelectricfocusing,CIEF)（六）毛细管电色谱（capillaryelectrochromatography,CEC)（七）微芯片毛细管电泳（microchipelectrophoresis)（三）毛细管凝胶电泳9应用与进展

毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核酸/核苷酸、蛋白质/多肽/氨基酸、糖类/糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小的生物活性分子等的快速分析，以及DNA序列分析和DNA合成中产物纯度测定等应用与进展毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血浆101、离子分析

analysisofion阳离子分析

迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；1、离子分析

analysisofion阳离子分析112、药物分析

analysisofpharmaceutics

检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；2、药物分析

analysisofpharmaceut12采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法133、手性化合物分析

analysisofchiralcompounds

HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；

形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）3、手性化合物分析

analysisofchiral144、氨基酸与蛋白质分析

analysisofaminoacids

采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；4、氨基酸与蛋白质分析

analysisofamino15蛋白质分析蛋白质分析165、核酸分析及DNA排序

analysisofnucleicacidsandsequence

ofDNA重要分析手段；酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；5、核酸分析及DNA排序

analysisofnucl17CE和HGP

目前，人类基因测序已基本完成，人类基因组计划进入后基因组时代。但是，耗资巨大的HGP至少在现阶段并没有产生原先设想的强大影响力。这是因为人类基因组图谱并没有告诉我们所有基因的“身份”以及它们所编码的蛋白质。人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，其中可能藏着开发疾病诊断方法和新药的“钥匙”。“后基因时代”，一个以“蛋白质组”为重点的生命科学的新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管电泳技术将发挥更大的作用。CE和HGP目前，人类基因测序已基本完成，人类基因18蛋白质肽片段混合物酶切CZE分离特征性肽图微量制备CE分别测定各片段的氨基酸序列整个蛋白质的一级结构CE应用举例---肽的分析蛋白质肽片段混合物酶切CZE分离特征性肽图微量制备CE分别测196、新进展

advancesandspecialtopics1）微型化整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m；2）联用仪器CE-MS；3）阵列毛细管凝胶电泳

应用于人类基因DNA测序；5～10万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的DNA序列分析仪，10小时/次；可同时电泳24个样品；速度1200碱基对/小时，提高速度！100支毛细管阵列电泳；速度280碱基对/小时/支6、新进展

advancesandspecialtop20第二节超高效液相色谱及其应用

UPLC第二节超高效液相色谱及其应用

UPLC21超高效液相色谱的发展

站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与质谱等检测技术联用时，也提出了更高的要求。因此，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行，或者说必须从理论高度对液相色谱重新认识。由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。

超高效液相色谱的发展站在当今世界科技22

超高效液相色谱技术的实现，主要是依靠以下几个方面的进步：

（1）小颗粒、高性能微粒固定相的出现；

（2）超高压输液泵的使用；

（3）高速采样速度的灵敏检测器；

超高效液相色谱技术的实现，主要是依靠以下几个方23

（4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器，配备了针内进样探头和压力辅助进样技术

（5）仪器整体系统优化设计：色谱工作站配备了多种软件平台，实现超高效液相分析方法与高效液相分析方法的自动转换。（4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器，配24分析速度快灵敏度高分离度好超高效液相色谱的优点分析速度快灵敏度高分离度好超高效液相色谱的优点250.000.040.080.120.160.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.001.Thiourea-0.4302.toluene-1.0343.propylbenzene-1.7424.butylbenzene-2.4135.hexylbenzene-5.058

样品的组份数：55µm颗粒度完全分离时间：6.00分钟0.200.241.Thiourea-0.0462.toluene-0.0883.propylbenzene-0.1374.butylbenzene-0.1825.hexylbenzene-0.360UPLC™AU0.000.100.20Minutes0.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.60UPLC™HPLC样品的组份数：51.7µm颗粒度完全分离的时间：0.60分钟UPLC的速度提高了！增加了样品的通量0.00AU0.000.040.080.120.160.000.501.26使用1.7µm颗粒度的填料增加灵敏度可看到更多的样品信息AU0.0000.0040.0080.0120.0160.020Minutes1.701.801.902.002.102.202.302.402.502.601.7µmAU0.0000.0100.0200.0300.0400.050Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.00AU0.0000.0100.0200.0300.0400.0505.0µm0.024恒定柱长时；UPLC™的灵敏度提高1.7倍（170%）！恒定L/dp时；UPLC™的灵敏度提高三倍（300%）！使用1.7µm颗粒度的填料增加灵敏度可看到更多AU0.00027UltraPerformanceLC™

速度、灵敏度与分离度的结合AU0.0000.0100.0200.0300.0400.050Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.00AU0.0000.0100.0200.0300.0400.050Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0015.005.0µm1.7µm60%更快30%更灵敏70%更高分离度在改进获得信息质量的前提下提高分析速度UltraPerformanceLC™

速度、灵敏度与28UltraPerformanceLC™

速度、灵敏度与分离度的结合HPLC3.5µmUPLC™1.7µm对流出时间接近的色谱峰有更好的分离度及更高的灵敏度生产力：每次实验得到更多信息AUAUUltraPerformanceLC™

速度、灵敏度与292.理论基础在高效液相色谱速率理论中，VanDeemter方程式的简化表达式：如果仅考虑固定相的粒度

对

的影响，其简化方程式可表达为：2.理论基础在高效液相色谱速率理论中，VanD30vanDeemter曲线带来的承诺如果填料的颗粒继续演变……更小的颗粒度……vanDeemter曲线带来的承诺如果填料的颗粒继续演变31填料颗粒尺寸的演变前景：2.1×100mm色谱柱1.7µm杂化填料颗粒可达到15,000psi通常有每米200,000理论塔板数的柱效速度、灵敏度及分离度的完美结合Minutes1.000.000.200.400.600.80AU0.0000.0200.040一分钟以内！填料颗粒尺寸的演变前景：速度、灵敏度及Minutes1.00323.UPLC仪器介绍检测器：光学及/或质谱检测器可调紫外或光电二极管矩阵；为UPLC™专门优化的流动池；高速检测色谱柱管理：创新的枢轴转动设计置色谱柱出口直接到检测器样品管理器：低扩散XYZZ’形式快速进样周期低交叉污染样品盘及/或样品瓶可选样品组织器两元溶剂管理：高压混合两元梯度四溶剂选择在线脱气低扩散设计UPLC的耐压能力3.UPLC仪器介绍检测器：色谱柱管理：样品管理器：两元溶剂333.1超高效液相色谱的C18色谱柱固定相粒度直径可达1.7µm色谱柱长可达3-5cm3.1超高效液相色谱的C18色谱柱固定相粒度直径可达1.7343.1.1色谱柱颗粒化学在杂化的碳-硅基质内具有桥式乙烷的1.7µm颗粒三官能团键合C18配体改善了高pH稳定性改善了硅胶的柱效和反压改善了低pH稳定性3.1.1色谱柱颗粒化学在杂化的碳-硅基质内具有桥式乙烷的353.1.2色谱柱硬件3.1.2色谱柱硬件36筛板、柱管和连接件，可在超过140MPa压力下装填，保证色谱柱高柱效和长寿命。筛板、柱管和连接件，可在超过140MPa压力下装填，保证色谱37

可记录进样次数、最大反压及温度智能芯片自动下载关键参数到色谱柱历史文件信息不可删除含有该色谱柱独特的分析证书eCord装置可记录进样次数、最大反压及温度eCord装置383.2超高效液相色谱的输液系统3.2超高效液相色谱的输液系统393.2.1二元溶剂管理系统高压混合二元梯度四溶剂选择在线脱气低扩散设计耐高压3.2.1二元溶剂管理系统高压混合403.2.2UPLC超高压输液泵的特性与普通HPLC的高压梯度系统相比，UPLC的梯度性能极佳当梯度陡度为1%，梯度范围为90%-100%时，超高压输液泵的梯度运行曲线3.2.2UPLC超高压输液泵的特性与普通HPLC的高压梯41

UPLC的重现性UPLC34次进样分析烷基芳酮混合物保留时间的重现性其精确度、可靠的梯度性能与HPLC的重现性不相上下UPLC的重现性UPLC34次进样分析烷基芳酮混合物保42UPLC的耐受性稳定性试验的条件： 从10到90%甲醇的1分钟梯度1000次进样 温度：55ºC 最大压力：8500psi 流速：1.3ml/min.AU0.000.050.100.150.200.250.300.35Minutes0.000.250.500.751.001.251.501.75ACQUITYUPLC™C18色谱柱2.1×30mm1.7µm黑色：第一次进样红色：第1000次进样UPLC的耐受性稳定性试验的条件： AU0.000.050.433.3超高效液相色谱的高速检测器UPLC光导检测器流通池示意图3.3超高效液相色谱的高速检测器UPLC光导检测器流通池示44采样速度快能减少谱带扩展以保持柱效灵敏度比HPLC提高2-3倍流通池体积小、池壁全折射而不损失光能量采样速度快流通池体积小、池壁全折射而不损失光能量453.4超高效液相色谱的自动进样器3.4超高效液相色谱的自动进样器46药品质量控制中的现代分析方法与技术课件47针内针装置外针刺破密封，内针插入样品容器底部吸取样品可达到微量取样（µL取样）减少死体积，降低谱带扩展快速自动取样低扩散、低交叉污染针内针装置外针刺破密封，内针插入样品容器底部吸取样品484.1超高效液相色谱的应用药物分析

如天然产物中复杂组分的分析

生化分析如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品食品分析如食品中农药残留的检测环境分析

如水中微囊藻毒素的检测其他

如化妆品中违禁品的检测4.1超高效液相色谱的应用药物分析如天然产物中复杂组分49高分辨串联质谱QTOFmicro

灵敏度高(pg-fg级)和选择性强得到的质谱谱图数据完整、品质高。因而，在天然产物，新药开发，药代研究和蛋白质组学领域的定性、定量分析研究方面占有重要地位。高分辨串联质谱QTOFmicro

灵敏度高(pg-fg级)50从HPLC-MS到UPLC-MS灵敏度明显提高从HPLC-MS到UPLC-MS灵敏度明显提高51UltraPerformanceLC™

先进的MS入口技术－代谢物IDHPLCUPLC™UltraPerformanceLC™

先进的MS入口524.2超高效液相色谱的展望UPLC可以更快的速度和更高的质量完成以往HPLC的工作，为用户节省宝贵的时间和日常溶剂消耗，从而获得最大的投资回报。UPLC的高分离度可从容面对复杂组份（如蛋白质与代谢组学等生化领域、天然产物）分离的挑战。UPLC的高灵敏度可检测更加痕量的目标化合物。UPLC的快速分析大量样品，实现高通量。4.2超高效液相色谱的展望UPLC可以更快的速度和更高的质53第三节手性高效液相色谱技术与应用

一

手性药物拆分机理

为了使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映体，就要提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。在对映体拆分理论中颇为流行的是“三点手性识别模式”。

第三节手性高效液相色谱技术与应用

一手性药物54ThalidomideEventThalidomideEvent55

美国食品与药品管理局（FDA）在1992年颁布了手性药物指导原则，要求所有在美国上市的外消旋新药，其生产者均需说明药物中所含的对映体各自的药理作用、毒性和临床效果。美国食品与药品管理局（FDA）在1992年颁56药品质量控制中的现代分析方法与技术课件57手性药物对映体的药效学差异1.治疗作用完全依赖一种异构体如：S(-)-α-甲基多巴2.药理作用差别不大如：异丙嗪3.药理作用类似，但反应强度有差别4.药理与毒理作用存在“质”的区别手性药物对映体的药效学差异58手性药物对映体的药动学差异1.吸收2.蛋白结合3.代谢手性药物对映体的药动学差异59手性药物的现状手性药物（579）药物（1992）天然和半合成药物（556）合成药物（1436）非手性药物（857）单一异构体（73）外消旋体（506）手性药物（547）非手性药物（9）单一异构体（537）外消旋体（10）手性药物的现状手性药物（579）药物（1992）60药品质量控制中的现代分析方法与技术课件61Worldwidesalesofchiraldrugs3504526148121330706934118003006009001200150019931994199519961997199819992000100million$Increasing8%peryear$200billion2008 (projected)Worldwidesalesofchiraldrug622004年全世界销售总额名列前20的药物在20种药物中手性单一对映体药物有10种无论是开发新药还是生产专利过期药手性药物(单一对映体)已成为世界的潮流手性分析是支撑手性技术的重要基础2004年全世界销售总额名列前20的药物在20种药物中手性单63手性药物对映体分离的方法（1）生物转化不对称催化法（2）液-液萃取法（3）传感器法（4）渗透膜法（5）重结晶法（6）色谱法：手性衍生化法（CDR）手性流动相添加剂法（CMPA）

手性固定相法（CSP）手性药物对映体分离的方法（1）生物转化不对称催化法64

1．柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固定相分离。

对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。

常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活性氨基酸类、固相衍生化试剂。1．柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍65

2.手性流动相拆分法（手性洗脱法或手性流动相添加剂法）：将手性试剂加入流动相中，手性添加剂与样品形成手性络合物。

常用的手性添加剂：配基交换型手性添加剂、环糊精类添加剂、手性离子对络合剂

2.手性流动相拆分法（手性洗脱法或手性流动相添加剂663.手性固定相拆分法：将手性选择剂固着于多种基质上而制成手性固定相。迄今为止，尚没有一种通用型的手性柱，需要根据化合物的分子结构来选择合适的手性柱。

常用的手性固定相：Pirkle型手性固定相、蛋白质类手性固定相、环糊精类手性固定相。

3.手性固定相拆分法：将手性选择剂固着于多种基质上而67给体—受体:如Pirkle型CSP，纤维素衍生物类:CDMPC主客体络合:如环糊精、冠醚类CSP手性配体交换色谱蛋白质类给体—受体:如Pirkle型CSP，68(S,S)-Whelk-O-1(R,R)-DNB-DPEDA(S,S)-Whelk-O-1(R,R)-DNB-DPE69Pirkle型CSP手性识别机理：“三点作用模式”chiraltargetorchiralstationaryphasePirkle型CSP手性chiraltargetorc70纤维素衍生物类CSP

纤维素是D(+)-葡萄糖单元由1,4-糖苷键形成的高度有序、呈螺旋型空穴结构的光学活性天然高分子

纤维素衍生物类CSP纤维素是D(+)-葡萄71纤维素三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC,ChiracelOD）

Okamoto：510（62%）几种常见的纤维素衍生物纤维素三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC,Ch72

（三）应用

1．对某些手性药物进行对映体的纯度检查；

2．生物体液中药物对映体的分离分析研究可探

索血药浓度与临床疗效的关系；

3．在研制手性药物过程中，可分别评价单个对

映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；

4．必要时，可进行手性药物对映体的制备分离

（或拆分）。（三）应用

1．对某些手性药物进行对73

示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的检查（柱前手性衍生化法）

手性衍生化试剂：乙酰葡萄糖异硫氰酸酯

色谱条件：色谱柱NOVA-PackC18（150mm×3.9mm）

流动相：甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾（pH2.8）（51∶49）该法所用的手性衍生化试剂可以与一级胺、二级胺在温和的条件下迅速反应，所生成的非对映体衍生物可以在普通色谱系统中进行分离分析。示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的检查（柱前手性衍生化法）

74示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流动相拆分法）

色谱条件：

色谱柱：ZorbaxODS（250mm×4.6mm），

流动相：含有0.15%L-苯丙氨酸及0.11%硫酸铜（CuSO4·5H2O）水溶液（以0.05mol/L硫酸调pH至3.0）-甲醇（9∶1）（流动相中L-苯丙氨酸及硫酸铜浓度分别为0.008mol/L和0.004mol/L）。

流动相中L-苯丙氨酸为配基交换型手性添加剂，硫酸铜为二价金属螯离子，L-苯丙氨酸与铜离子螯合，分布于流动相中，遇到色氨酸对映体，共同形成配位络合物对，然后在反相柱上拆分。示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流动相拆分法）

色谱条件：

75

示例三、克仑特罗对映体的拆分（手性固定相拆分法）

色谱条件：

色谱柱Chirex3005手性色谱柱

[（R）-1-萘基甘氨酸和3，5-二硝基

苯甲酸以共价键结合]

流动相正己烷-二氯乙烷-甲醇

该法的拆分机理为“三点手性识别模式”。

示例三、克仑特罗对映体的拆分（手性固定相拆分法）

色谱条件76甲硫氨酸对羟基苯甘氨酸TECSPTECSPMP-TECSPMP-TECSPPCl-TECSPPCl-TECSP甲硫氨酸对羟基苯甘氨酸TECSPT77

第四节GC-MS和LC-MS技术与应用

色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。

色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。

第四节GC-MS和LC-MS技术与应用色谱质78GC-MS(gaschromatogram–massspectrum)GC-MS79测试流程待测样品待测样品

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)色谱分离

质谱定性BACD测试流程待测样品待测样品58901.0DEG/MI80GC部分MS部分接口部分数据处理系统GC部分81联用仪内部结构联用仪内部结构82接口：协调联用仪器输出和输入状态的硬件设备分类直接接口(小内径毛细管柱)开口分流接口(大内径毛细管柱)作用降低压力除去载气传输组分1毛细管柱;2内套管;3接MS的限流毛细管;4尾吹气入口;5尾吹气出口接口：协调联用仪器输出和输入状态的硬件设备分类1毛细管柱;83谱图类型色谱图质谱图TotalIon色谱图Mass色谱图SelectIon监测图FullScan质谱图SIM质谱图谱图类型色谱图质谱图TotalIon色谱图Mass色谱84总离子流色谱图Totalioncurrentchromatogram,TIC

在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,也称TIC图.

质量色谱图Masschromatogram

在一次扫描中，只记录某原子质量单位(m/z)的离子流强度随时间变化所得的色谱图

质谱

GC-MS能给出总离子流色谱图上每一个色谱峰的质谱图总离子流色谱图85色谱图比较MassChromatogramTotalIonChromatogram色谱图比较MassChromatogramTotalIo86

应用：1.生命科学、生物技术中应用2.药物分析研究中应用3.环境分析研究中应用4.食品安全分析研究中应用5.石油化工分析研究中应用6.疾病预防控制中应用7.法庭科学中应用应用：87液质联用与气质联用的区别:

气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。

液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。

液质联用与气质联用的区别:气质联用仪(GC-MS)88现代有机和生物质谱进展

在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。在此之前，质谱法通常只能测定分子量500Da以下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达1500~2000Da的非挥发性化合物，但重复性差。20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FAB-MS），能够分析分子量达数千的多肽。

随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂，分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-MS）应运而生。现代有机和生物质谱进展在20世纪80及90年代，质89

目前的有机质谱和生物质谱仪，除了GC-MS的EI和CI源，离子化方式有大气压电离（API）（包括大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI）与基质辅助激光解吸电离。前者常采用四极杆或离子阱质量分析器，统称API-MS。后者常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。API-MS的特点是可以和液相色谱、毛细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、组合化学、有机化学的应用等；MALDI-TOF-MS的特点是对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快，操作简单。目前的有机质谱和生物质谱仪，除了GC-MS的EI和C90

LC-MS中的接口技术电喷雾接口大气压化学电离 LC-MS中的接口技术电喷雾接口91药品质量控制中的现代分析方法与技术课件92

电喷雾（ESI）的特点

通常小分子得到[M+H]+]+,[M+Na]+或[M-H]-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物大分子。

电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。电喷雾（ESI）的特点通常小93大气压化学电离（APCI）特点

大气压化学电离也是软电离技术，只产生单电荷峰，适合测定质量数小于2000Da的弱极性的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控制离子的碎裂。大气压化学电离（APCI）特点大气压化学电离也是软94

正负离子模式:

一般的商品仪器中,ESI和APCI接口都有正负离子测定模式可供选择。

根据样品的性质选择，也可两种模式同时进行正负离子模式:95LC-MS分析条件的选择和优化1.接口的选择：ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质）APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。LC-MS分析条件的选择和优化1.接口的选择：96

2.正、负离子模式的选择：

选择的一般原则为：

正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。

负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。2.正、负离子模式的选择：选择的一般原则为97

3.流动相的选择

常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。

LC／MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸铵＜10一5mmol/l。

送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。3.流动相的选择98

4.流量和色谱柱的选择

不加热ESI的最佳流速是1—50ul／min，应用4.6mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用l—2.1mm内径的微柱，TIS源最高允许lml／min，建议使用200—400ul／min

APCI的最佳流速～lml／min，常规的直径4.6mm柱最合适。

为了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。4.流量和色谱柱的选择995.辅助气体流量和温度的选择

雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20℃左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。

选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。5.辅助气体流量和温度的选择雾化气对流出液形成100化合物鉴别全扫描方式（Q1扫描）

全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子，从而可判断出化合物的分子量，用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的化合物，如合成化合物的质量及结构。

子离子分析（MS/MS）

用于结构判断(得到化合物的二级谱图即碎片离子)和选择离子对作多种反应监测（MRM）。

子离子谱图与锥体电压断裂谱图（源内CID）可能十分相似，所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过MS1，因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的，所以我们更相信由MS/MS产生的谱图的纯度。化合物鉴别全扫描方式（Q1扫描）101LC-MS技术的应用

以大气压电离为接口的LC-MS技术已经在药物、化工、临床医学、分子生物学等许多领域中获得广泛的应用LC-MS技术的应用以大气压电离为接口的LC-MS技102

医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析

生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖

环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析

临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸

食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物

法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测

兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体

合成化学：有机金属化合物、有机合成物

有机化学：表面活性剂、染料医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产103药物代谢研究

药物代谢与药物动力学研究技术上的最新重大进展是LC-MS-MS的使用，电喷雾（ESI）和大气压化学电离（APCI）以及大气压光电离（APPI）是其主要的离子源，由