免疫学检测技术的基本原理-课件

第二十二章免疫学检测技术的基本原理

p229第二十二章免疫学检测技术的基本原理

p229一.体外抗原抗体反应的特征

1.高度特异性抗原的表位与抗体的抗原结合点结构互补。

2.可见性抗原与相应抗体结合后能肉眼直接观察。二.抗原抗体反应的影响因素

1.温度：最适温度为37℃。

2.酸碱度：最适pH=6-8。

3.电解质：可促进抗原与抗体的结合。常用生理盐水。一.体外抗原抗体反应的特征抗原抗体比例对反应现象的影响抗原抗体比例对反应现象的影响三.检测抗原和抗体的体外试验（一）凝集反应

颗粒性抗原（RBC、细菌等）与相应抗体结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。

1．直接凝集试验（1）玻片凝集试验：用于定性测抗原。如ABO血型鉴定，细菌的鉴定、分型等。（2）试管凝集试验：用于定量测抗体如肥达氏反应。

2．间接凝集试验如类风湿因子的测定等。三.检测抗原和抗体的体外试验免疫学检测技术的基本原理--课件（二）沉淀反应

可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故又称为琼脂扩散试验或免疫扩散。

（二）沉淀反应1．单向免疫扩散用于定量测抗原。如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。

1．单向免疫扩散用于定量测抗原。2．双向免疫扩散主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两种抗原相关性分析。2．双向免疫扩散3．免疫电泳

其方法是先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断。

3．免疫电泳

4．免疫比浊用于定量测抗原。该法快速、简便。5）免疫比浊法

在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成免疫复合物。用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多，浊度越高，绘制标准曲线并根据反应液体的浊度，推算样品中的抗原含量。4．免疫比浊5）免疫比浊法在一定（三）免疫标记技术

用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，且极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：

免疫荧光技术免疫酶技术同位素标记技术

（三）免疫标记技术1．免疫荧光技术(ImmunofluorescenceTechnique)

用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。

（1）常用荧光素异硫氰酸荧光素（FITC），显黄绿色。藻红蛋白（PE），显红色。（2）方法

*直接荧光法：

优点--特异性强缺点--每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。

*间接荧光法优点--敏感性比直接法高，且制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，缺点--非特异性荧光增加。1．免疫荧光技术(ImmunofluorescenceTe免疫学检测技术的基本原理--课件免疫学检测技术的基本原理--课件2．酶免疫测定（EnzymeImmunoassay,

EIA）用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。其检测的敏感度可达pg-ng/ml水平。

Ab+EAbE

Ag+AbEAgAbE+底物

呈色反应2．酶免疫测定（EnzymeImmunoassay,EEIAEIA（1）标记的酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。（2）常用方法:A酶联免疫吸附试验

(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)

将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除.

用于可溶性抗原和抗体的检测。

（1）标记的酶：*

间接法：用于检测抗体*间接法：用于检测抗体*

双抗体夹心法：用于检测抗原。*双抗体夹心法：用于检测抗原。B免疫组化技术—检测组织中或细胞表面的抗原。

对抗原进行定性、定量、定位检测。

C酶联免疫斑点试验（ELISPOT）

可用于细胞因子的检测B免疫组化技术—检测组织中或细胞表面的抗原。3．放射免疫测定法（RIA）

敏感度可达pg水平，其标记物为125I、131I等。常用于微量物质的检测，如激素、IgE等。

3．放射免疫测定法（RIA）4．化学发光免疫分析

该法是将发光物吖啶酯、或鲁米诺标记抗原或抗体进行的结合反应。

发光物质在反应剂激发下生成激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时发射出光子，用自动发光分析仪能接收光信号，测定光子的产量，以反映待检样品中抗体或抗原的含量。其灵敏度高于RIA，常用于超微量物质的测定，如甲状腺素等。4．化学发光免疫分析5．免疫印迹法（Westernblotting）该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即将电泳分区的蛋白质转移