病原生物学综合性实验一脓汁和粪便标本中病原菌的检测

综合性试验一脓汁和粪便标本中病原菌的检测从临床标本中分别细菌的目的是为了查找与疾病有关的病原菌，这对于临床治疗及预后调查是很有价值的。所以，在分别时应把握以下原则，以便指导检出病原菌，避开漏诊误诊。1．了解微生物在人体的分布。人体的很多部位与外界相通，存在正常菌群，分别时应留意标本中的菌群是正常菌群的污染，还是致病菌。另外，机体的某些部位(如血液、骨髓)是无菌的，如检出细菌，应视为致病菌。2．了解标原来源及临床状况，以便有目的地检出病原菌。3．依据标原来源和可能存在的病原菌确定选用各种分别培育基，以提高检出率。如血平板可用于化脓性链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌等的分别。常见的化脓性病原菌有葡萄球菌、链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、假单胞菌、流感杆菌等。脓汁标本在做细菌分别培育的同时，均须直接涂片检查，观看是否有典型形态的菌体，芽胞有无，为临床供给最初的诊治依据。SS碱性蛋白胨水)，尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、困难梭菌等。粪便标本中因各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辩是否为病原菌，因此，粪便标本一般不作直接涂片检查，只有检查霍乱弧菌、结核杆菌、疑似葡萄球菌或困难梭菌引起的伪膜性肠炎，以及菌群失调时，才作直接涂片检查。细菌鉴定工作的原则及根本方法是：1、必需用纯的细菌培育物作鉴定。由于不同的细菌生化反响结果相差较大，而反响结果是以阳性或阴性表示的，一旦用混合菌做生化反响，结果不行分析。2、鉴定方法的选择。测定细菌特征的试验方法很多，应依据鉴定目的选择有价值的、快速简便的试验工程，既能完成鉴定，试验工程又尽可能少。一、培养基的制备PreparationofCultureMedia【试验目的】了解细菌生长的根本养分条件。生疏培育基的种类。把握培育基制备的原则和一般方法。【试验原理】培育基是用人工方法将微生物生长生殖所需要的多种养分物质，按比例混合配制而成的养分制品，其主要用途是分别培育纯种微生物，传代或保存微生物，鉴别微生物的种属，争论微生物的生理及生化特性，制造疫苗、微生态制剂或其他微生物制剂。培育基根本成分包括：(1)养分物质，如碳源、氮源、无机盐和生长因子等；(2)水份；(3)凝固物质，最常用的凝固剂为琼脂；(4)抑制剂，如胆盐、抗生素等，其目的是抑制非检出菌的生长或使其少生长，有利于检出菌的生长。培育基的种类很多，依据物理性状，培育基可分为固体、半固体和液体培育基三种，固体培养基又有平板和斜面之分。依据用途，培育基可分为：根底培育基含有一般细菌生长生殖需要的最根本的养分物质，可作为一些特别培育基的根底成分。养分培育基在根底培育基中参加某些特别养分物质如血液、血清或生长因子等，用以培育养分要求较高的微生物。选择性培育基利用微生物对某些化学物质的敏感性不同，在培育基中参加这类物质，抑制不需要的微生物生长，有利于所需分别的微生物生长，从而到达分别或鉴别某种微生物的目的。鉴别培育基是一类含有某种特定化合物或试剂的培育基。某种微生物在这种培育基上培育后，产生某种特定代谢产物，与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反响。培育基的制备原则：(1)适当的养分成分；(2)适宜的酸碱度；(3)配制后经灭菌手续使之无3724培育基制备程序可分为调配、溶化、矫正pH、分装、灭菌、检定及保存等步骤。制备好的培育4℃冰箱中。【试验内容和方法】一肉汤培育基(meatinfusionbroth)的制备供作一般细菌培育的根底培育基，其成分为：3g10gNaCl5g蒸馏水1000mlpH7.4～7.6【材料】天平称量纸药勺pH试纸(pH5.4～9)三角烧瓶量筒试管试管架5ml吸管吸头棉塞标签纸牛皮纸线绳【方法】称取肯定量的肉汤培育基，置于三角烧瓶中，参加适量的蒸馏水。溶解后校正pH至7.4～7.6，分装到三角烧瓶或试管中(装量以试管高度的1/4左右为宜)。多数生化试验用的鉴别培育基，可分装于毛细玻璃管内，加热熔封，灭菌后备用。三角烧瓶和试管口塞上用一般棉花制作的棉塞(棉塞的外形、大小和松紧要适宜，才能起到防止杂菌侵入培育基内而造成污染和有利通气的作用)，在棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。贴上标签，灭菌后使用。二一般养分琼脂培育基(nutrientagar)的制备琼脂是从海藻中提取的一种胶体多糖类物质，一般不被细菌分解利用，故对细菌无养分作用，其特点是能在100℃溶化、40℃以下凝固，因此，它是作为固体培育基赋形的抱负凝固剂。将不同量的琼脂参加肉汤中趁热可制成斜面、平板等不同类型的固体培育基(含琼脂2～2.5%0.3～0.5%)，供分别、培育、传代和保存细菌等使用。【材料】一般养分琼脂培育基蒸馏水三角烧瓶平皿试管5ml吸管酒精灯【方法】在上述配制的肉汤培育基中参加2－2.5%的琼脂，或者称取肯定量的养分琼脂培育基，置于三角烧瓶中，参加适量的蒸馏水。灭菌后冷却至50～60℃(以防止冷凝水太多)时，以无菌操作倾入已灭菌的平皿中制成平板。假设平皿内径为9cm，可倾注12～15ml；假设内径为7cm的平皿，倾注10～12ml。轻轻摇动平皿底部，待凝固后即成。假设要制作斜面，灭菌前将培育基溶化、分装到试管中(装量不超过试管高度的1/5)，灭1/2)。假设要制作半固体培育基，分装量可为试管长度的1/4～1/3，灭菌后趁热直立待凝。三血平板(bloodagar)的制备适于各类细菌生长，链球菌、肺炎球菌等养分要求较高的细菌必需要用血平板。一般细菌检验标本的分别多应接种血平板。在血平板上除了可以观看菌落的形态外，还可推断溶血状况。【方法】将已灭菌的一般养分琼脂培育基加热溶化。冷却至50℃左右时，参加10%无菌脱纤维羊血(临用前，应置于37℃水浴预温)，轻轻摇匀。以无菌操作倾入灭菌的空培育皿中。四、伊红美蓝(EMB)培育基的制备分别肠道致病菌用，其成分为：5g10g氯化钠5g15g10g蒸馏水1000ml2Y水溶液20ml0.5%美蓝水溶液20mlpH7.2～7.4注：伊红、美蓝为指示剂，且有抑制革兰氏阳性菌生长的作用。大肠杆菌分解乳糖产酸，使伊红与美蓝呈色，形成紫黑色菌落，且有金属光泽；肠道致病菌不发酵乳糖，菌落呈粉红色，有时可因碱性物质较多，细菌带负电荷染上美蓝而呈蓝色菌落。【方法】加热溶化已灭菌的蛋白胨、肉汤琼脂，溶化后马上趁热参加已灭菌的乳糖。待冷却至50～60℃时，参加已灭菌的伊红及美蓝水溶液，充分摇匀。以无菌操作倾注平皿。凝固后，冷藏备用。【留意事项】●搅拌或振荡器皿或延长放置时间，以促进枯燥培育基的溶解。●枯燥培育基一般已校正pH。用时须再验证。通常培育基灭菌后pH约可降低0.1～0.2，在矫pH0.1～0.2。●倾注培育基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落入。●琼脂平板放4℃冰箱保存，正面对下(倒置)，以防细菌落入而污染。●制成的平板培育基外表水分较多，不利于细菌的分别，可将平板倒置于37℃培育箱内约30【思考题】①人工培育细菌需要供给的条件是什么?②培育基制备的原则是什么?③如何证明培育基灭菌是否彻底?④怎样检查培育基是否合格?⑤培育基按物理外形分哪几种?各有何用途?二、消毒与灭菌DisinfectionAndSterilization【试验目的】了解理化因素对细菌的影响。把握常用的消毒灭菌法。【试验原理】微生物广泛存在于四周环境，其中有些又是病原微生物，因此，从预防感染动身，医务工作者必需建立无菌观念和严格执行无菌操作，这就要求必需对所用的物品(如注射器、手术器械、手术衣等)和工作环境(如无菌操作室、手术室、产房等)进展灭菌或消毒，以确保所用的物品和工作环境的无菌或处于无菌状态；为防止疾病的传播，对传染病患者的排泄物和实验废弃的培育物亦须进展灭菌或消毒处理。微生物学试验一般都需要在无菌条件下进展，为此必需对培育基、试验器材和试剂等进展灭菌，并严格执行无菌操作。可见，消毒与灭菌是微生物学和临床医学必不行少的根本学问。物理灭菌方法有干热灭菌、湿热灭菌、过滤灭菌等，可依据具体状况选用不同的灭菌法。干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和镊子等，无菌操作时的试管口、瓶口也可在火焰上作短暂烧灼灭菌。煮沸100℃经5～10分钟，可杀死细菌的生殖体，但不能杀死细菌的芽胞。因此，煮沸法主要用于一般外科手术器械、胶管和注射器等的消毒，亦可用于饮水和食具的消毒。高压蒸汽灭菌法是试验室中最常用最有效的方法。水在大气压中100℃左右沸腾，大气压增加沸腾温度将随之增加。因此，在密闭的高压灭菌器内，当蒸汽压增加到1.05kg/cm2(15磅)时，温度则到达121.3℃，在这种温度下，15～30分钟即可杀死全部微生物及细菌的芽胞。凡能耐高热和潮湿的物品如培育基、生理盐水、纱布、手术器械、注射器、玻璃器材等都可应用高压蒸汽灭菌法灭菌。过滤除菌法适用于除去糖溶液、血清培育基、药物等不耐热液体中的细菌，所用设备为滤菌器，由孔径细小，能阻挡细菌通过的纤维素膜、陶瓷板、石棉板等制成。各种滤膜或滤板的滤孔大小不同，可供选择。波长200～300nm之间的紫外线具有杀菌力量，尤以波长为260nm杀菌力量最强。紫外线通过干扰细菌DNA的复制而使细菌死亡。因紫外线穿透力不强，可被一般玻璃及纸片吸取，所以常用于试验室、手术室、传染病房等的空气及物体外表的消毒。紫外线灯距照耀物以不超过1.2米为宜，照耀20～30分钟即可杀死空气中的细菌。化学消毒剂一般对病原微生物和机体都有毒性，因此只能用于物品、四周环境以及人体体表局部的消毒。消毒剂的作用原理：(1)使菌体蛋白质变性或凝固，如含汞的重金属盐类、龙胆紫、酒精、甲醛等；(2)破坏细菌的酶系统，如高锰酸钾、双氧水、碘液、漂白粉等；(3)转变细菌细胞壁或细胞膜的通透性，如洁尔灭、肥皂、来苏儿等。1提式高压蒸汽灭菌器示意图12345.安全阀6789.10.排气管11121314.筛片【试验内容和方法】一高压蒸汽灭菌法(autoclaving)手提式高压蒸汽灭菌器(见图1)是一双层筒状金属容器，两层之间盛水，外筒坚厚，上端有盖，盖旁附有螺旋，使用时将螺旋扭紧，使盖紧闭蒸汽不能外溢。盖上装有排气阀门和安全阀门，以调整器内蒸汽压力，压力表表示内部温度和压力。内筒用于盛放欲灭菌的物品。【方法】先向器内加水，然后把要灭菌的物品装入内筒，将器盖盖好，拧紧螺旋。翻开排气阀门，加热，待冷空气完全排出后再关闭排气阀，连续加热。待器内压力上升到所需数值(一般为15磅)时，削减炉火，使压力维持不变，约15～30分钟。关闭热源，自然放凉，待压力表指针下降到零后，翻开排气阀，开盖取物。【留意事项】●灭菌时，应严格按操作程序进展，切勿擅自离开，尤其是升压和保压期间要留意压力表指针的变化，避开压力过高而导致培育基中养分成分被破坏，以及意外事故的发生。●高压蒸汽灭菌时，必需待器内冷空气完全排出后才可关闭排气阀加压，否则即使压力到达15121℃，不能到达灭菌效果。●务必待压力下降到零时，方可开盖，否则会因器内压力突然下降，致使瓶内液体冲出瓶外。●现在最常用的培育基灭菌条件是15磅15分钟，时间过长有可能破坏培育基的养分成分。含糖的生化培育基的灭菌条件是10磅(115.6℃)15分钟。器皿的灭菌可以是15磅20二、紫外线杀菌试验(germicidaltestofUV)【材料】大肠杆菌肉汤培育物一般养分琼脂平板灭菌的L形玻璃棒灭菌的“A”字形黑纸片【方法】通过无菌操作，用接种环沾取大肠杆菌菌液放到平板培育基上，然后用灭菌的L形玻璃棒均匀涂布于整个平板。镊子在火焰上灭菌后，夹取灭菌的“A”字形纸片，置于琼脂平板中心，然后将平板打60～80cm30照耀完毕，用无菌镊子将黑纸片取出烧掉或投入消毒缸内，随即盖好皿盖，37℃培育24小时，观看和分析结果。三化学消毒法(disinfectionbychemicalfactors)【材料】大肠杆菌肉汤培育物金黄色葡萄球菌肉汤培育物0.1%洁尔灭2%红汞2%龙胆紫生6.5mm【方法】首先在琼脂平板底部标记上述化学消毒剂的名称，留一比照位置。将葡萄球菌与大肠杆菌培育物分别均匀涂布于两块琼脂平板培育基上。用灭菌镊子夹取无菌滤纸片分别蘸取2%红汞、2%龙胆紫、0.1%洁尔灭、生理盐水(比照)，轻轻贴于琼脂平板外表勿移动，纸片间的距离约3cm。将平板置于37℃温箱培育24小时后观看结果。纸片四周无细菌生长的区域，称为抑菌环。通过比较消毒剂的浓度与抑菌环直径的大小，即可了解化学消毒剂的杀菌作用。【思考题】①高压蒸汽灭菌法、紫外线、青霉素、碘酒的杀菌机理各是什么?②影响化学消毒剂抑菌杀菌的因素有哪些?③啤酒、饮料常用什么方法消毒?④为什么说消毒与灭菌是微生物学和临床医学必不行少的根本学问?三细菌的分别与培育IsolationAndCulturingofBacteria【试验目的】把握无菌操作技术。把握病原菌的分别与培育方法。【试验原理】细菌学检验所接触的标本，均来自临床病人，大多数是含有病原菌而具有传染性的材料。如果操作和处理不当，可导致试验室感染和医院内感染。为此，细菌学检验，特别是细菌培育必需随时为防止污染和病原菌的集中而进展操作，为达此目的的技术就是无菌操作。细菌的接种技术主要有：平板划线分别法，斜面、液体或半固体培育基接种法。为避开在接种过程中污染环境和空气中的细菌污染培育物，细菌接种一般应在超净工作台或无菌室内进行。鉴于学生试验室的实际条件，要求学生在酒精灯旁进展细菌接种。细菌的培育技术可分为：(1)一般培育法即需氧培育法，将已接种好的培育基置于37℃恒温箱中培育18～24小时，一般细菌即可在培育基中生长生殖。(2)CO2培育法某些细菌，如脑膜炎球菌、布氏杆菌等，需在增CO2的环境中培育才能生长良好，可承受CO2(3)厌氧培育法(见综合性试验二·厌氧菌的检验一节)。人工培育细菌在医学中的实际应用主要有四个方面：细菌的鉴定和争论细菌的人工培育是鉴定细菌种属的根本手段。观看细菌的形态，了解各种细菌的培育特性、代谢活动、生化反响、抗原构造、致病力等，均须首先培育纯种细菌，使其生殖到足够的数量。感染性疾病的诊断和防治由细菌所引起的感染性疾病，最精准最牢靠的诊断依据(金标准)是用人工培育法，从病人材料中把病原菌分别培育出来，并鉴定其种型。为选择有效的抗菌药物对病人进展合理治疗，也必需通过人工培育方法，将从病人检出的病原菌进展药物敏感试验。生物制品的制备供某些传染病血清学诊断使用的细菌诊断液、供预防接种用的活菌或死菌菌苗和类毒素、供治疗使用的免疫血清或抗毒素血清或微生态制剂等生物制品，在其制备过程中均须进展细菌的人工培育。菌种的保存从不同来源分别培育的菌株，以及试验室常备的标准菌株，常需保存较长时间以备应用。【试验内容和方法】一细菌分别培育法(isolationofpureculture)细菌在自然界分布甚广，种类繁多，被检的临床标本常含有多种细菌，假设要证明该标本中是否存在某种细菌，或特地争论其中一种细菌等，必需进展细菌分别与纯化，获得纯种培育物。通常承受平板划线法从临床标本中分别出病原菌，即：借助划线而将混杂的细菌在琼脂平板上分散开来，使单个细菌能固定在一点，在适宜的温度下生长生殖后，各自形成肉眼可见的细菌集团——单菌落，进而依据菌落形态特征，将单菌落移植传代后进展大量增殖所得的菌种，称为纯种微生物(纯培育)。常用接种工具可分为接种针和接种环两类。接种环用来挑取标本菌液及划菌落涂平板等。接种针则用来挑取单个菌落，穿刺培育等。用于制作接种针或接种环的金属丝通常用镍铬丝或铂丝做成，具有红得快、冷得快速、能经受反复烧灼、不易氧化、无毒性，且软硬适中等特性。【材料】脓汁标本粪便标本一般养分琼脂平板伊红美蓝琼脂平板接种环酒精灯【方法】右手拿接种环(如握笔式)，烧灼灭菌，欲伸入试管内的接种环杆局部亦要快速通过火焰2～3左手握住盛有标本的试管的下端，右手以无名指、小指与手掌在火焰旁拔出试管棉塞并挟住之，将管口快速通过火焰三次灭菌。马上将已灭菌冷却的接种环伸入试管内，沾取标本(或菌液)一环。试管口火焰灭菌后塞2)。图2无菌取材的根本步骤左手斜持平板，略开盖，在酒精灯火焰左前方约5～6cm处，将接种环上的菌液涂抹于平板外表的边缘局部。烧灼接种环，冷却后，将接种环自涂抹局部沾取少许菌液，使接种环与平板外表成30～40°角，用腕力将接种环在平板外表来回轻快地划线，动作要轻松，划线要密但不能重叠，充分利用平板的面积。3以上为曲线划线分别法(见图3)，多用于接种材料中含菌数量相对较少的标本或培育物。而分区划线分别法(见图4)多用于粪便等含菌量较多的标本，方法是：从原涂抹局部开头，连续平行划线，每次只划平板的1/4～1/5，划毕后接种环再经火焰灭菌，冷却后用同样方法在平1～33～4接种完毕，将接种环烧灼灭菌前方可放下。将培育皿倒置(琼脂平板的底部向上)，37℃培育24小时后，观看结果。45好环映型【留意事项】●每次取菌(或接种)前后，均须烧灼接种工具，接种完毕，不能直接将接种环在火焰中烧灼，以免环上的细菌或标本因受高热爆烈四溅，应先将细菌或标本烤干后再烧灼。●不要划破琼脂外表。●留意无菌操作，防止空气中微生物掉入平板中造成污染。●初学者可将平皿盖翻开放在试验台上，再行划线接种。二斜面培育基接种法(inoculationofslantmedium)用于细菌增殖和菌种传代、保存。【方法】(见图5)右手拿接种针(环)，烧灼灭菌(方法同前)，冷却后，左手拿平板并略翻开平皿盖，通过无菌操作挑取少许菌苔或一个单菌落。左手快速放下平板，握住一个斜面培育基管的下端(斜面部应向上，勿成水平，以免凝固水浸湿培育基外表)。右手以无名指、小指与手掌在火焰旁拔出斜面培育基管棉塞并挟住之，将管口快速通过火焰三次灭菌。马上将接种针(环)伸入斜面培育基管内，在琼脂外表先从底部向上行拉一线，然后自下而上轻轻地作曲折连续划线，勿触破培育基外表。接种完毕，试管口快速通过火焰2～3次灭菌，塞好棉塞。接种环或针烧灼前方可放下。斜面培育基管置于37℃培育过夜。三液体培育基接种法(inoculationofliquidmedium)用于测定细菌生化特性，观看细菌的不同生长状况。【方法】接种环接种法：通过无菌操作(方法同前)挑取菌苔少许或菌液一环，马上移入肉汤培育基管中，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌液混合于培育基中，混匀。接种完毕，试管口快速通过火焰2～3次灭菌，塞好棉塞。接种环烧灼前方可放下。移液管或滴管接种法：先拧断移液管或滴管大口端的包扎纸，套上吸球抽出移液管，并且不要触及其他物体以防污染。左手拿菌种管，右手的拇指和食指夹住移液管和吸球，用小指和掌边拔出试管棉塞，将移液管或滴管伸入菌种管中，吸取菌液后马上接种至肉汤培育基管或三角烧瓶中，然后管口火焰灭菌塞上棉塞，充分摇动几下使菌液与培育基混匀。带菌的移液管或滴管应浸入5%石炭酸缸中，至少浸30分钟。四半固体培育基接种法(穿刺接种法)(inoculationofsemi solidmedium)用于细菌动力试验，即观看细菌有无运动力量。6接种法【方法】(见图6)如斜面培育基接种法握持菌种管及待接种的半固体琼脂培育基。右手握接种针，灭菌冷却后，挑取菌苔少许，垂直刺入半固体琼脂培育基的中心，可刺达近管底处，但不要达于管底，然后沿原路退出。接种完毕，试管口快速通过火焰2～3次灭菌，塞好棉塞。接种针烧灼前方可放下。斜面培育基管置于37℃培育过夜。【思考题】①做细菌培育时，平板为什么要倒放?②培育细菌的常用方法有哪些?③从临床标本中分别病原菌，应留意哪些事项?④为什么接种环在使用前、后都必需烧灼灭菌?无视了有什么危害?⑤半固体穿刺接种时，为什么要强调“原路返回”?四细菌群体生长特征的观看ObservationofGrowthCharacteristicsofBacterialPopulation【试验目的】了解并比较细菌在固体、半固体及液体培育基上的生长特征。【试验原理】不同的细菌生长在肯定的培育基上往往有不同的特征，因此，培育特征可以作为细菌分类鉴定的重要依据。【试验内容】一观看细菌在固体培育基上生长特征平板菌落特征细菌在琼脂平板上培育肯定时间后，形成菌落。各种细菌菌落都有肯定的特点，表现在以下几方面：3mm1～3mm1mm②外形：圆形，卵圆形、假根形、丝状、不规章等。③边缘：整齐，锯齿状，波浪状，羽毛状。④外表：隆起、平坦、中心凸起、脐形凹陷；光滑或粗糙、潮湿或枯燥。⑤溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落四周呈草绿色、不透亮)，溶血(菌落四周消灭透亮环)。⑥色素：一般为无色或灰白色，特别色素有两类：脂溶性色素(菌落本身着色，培育基不着色)和水溶性色素(菌落及培育基均着色)。斜面菌苔的特征不同的细菌在斜面培育基上生长，往往也具有肯定的特征，表现在生长量、菌苔外形(如线状、念珠状、假根状、薄膜状等)、外表外形、光泽、透亮度、颜色等方面。二细菌在液体培育基中生长特征的观看细菌在液体培育基中生长可消灭肉眼可见的各种特征，如培育液浑浊或澄清，消灭形态不一(如絮状、块状等)的沉淀，或在培育基外表形成菌膜(薄膜、厚膜或仅沿管壁产生一圈菌膜即菌环等)。三细菌在半固体培育基上生长特征的观看不同的细菌经半固体培育基穿刺接种后生长状况不同。能运动的细菌，往往沿穿刺线集中生长(即有动力)，而使穿刺线四周消灭模糊或混浊；不能运动的细菌仅沿穿刺线生长；严格好氧菌仅外表生长，兼性厌氧菌沿整个穿刺线生长。五细菌个体形态特征的观看ObservationofMorphologicCharacteristicsofBacteria【试验目的】把握油镜的正确使用。把握细菌涂片标本的制备。把握革兰氏染色法。生疏细菌的根本形态。了解细菌的特别构造。【试验原理】细菌是一类具有细胞壁的单细胞微生物，在肯定环境下有相对恒定的形态构造。尽管细菌菌落肉眼可见，但要观看单个细菌细胞，必需借助光学显微镜将其放大900～1000倍，因此，把握显微镜的使用方法是争论细菌的根本技能。在微生物学中主要使用的是油镜。油镜是因为在使用时需要香柏油作介质而得名。细菌菌体在强光下呈透亮或半透亮，其折光系数与玻璃片相像，在光学显微镜下难以看清楚，所以，必需将细菌制成涂片，固定后，用化学染料使菌体着色，从而和四周背景产生鲜亮比照，才能观看到细菌的形态与构造。染色方法有单染法和复染法。单染法是只用一种染料染色，如美蓝或复红，能清楚观看菌体大小、形态与排列，但不能鉴别细菌。复染法，即鉴别染色法，是用两种或两种以上染料，可将细菌染成不同的颜色，用于帮助鉴别细菌。常用的复染法有革兰氏染色法和抗酸染色法。革兰氏染色法是细菌学中最为经典的、广泛应用的染色法，可将细菌分成两大类：革兰氏阳性(G+)菌和革兰氏阴性(G-)菌。革兰氏染色法的原理尚不完全清楚，主要有三种学说：通透性学说：G+菌细胞壁构造比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻挡染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫—碘复合物简洁被酒精脱出。等电学说：G+菌等电点(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般pH7.0右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合结实，不易脱色。化学学说：G+菌细胞内含有某种特别化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料—媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。革兰氏染色法的实际意义有鉴别细菌、指导临床上选用有效药物和了解细菌的致病机理。在细菌分别培育或细菌药敏试验来不及做的状况下，常可依据细菌涂片染色镜检的初步结果来选择用药，有利于及早掌握感染。【试验内容和方法】一油镜的使用和保护(useandcareofoil immersionmicroscope)1将显微镜平置于试验台上。转动物镜转换器使低倍镜与镜筒垂直到位(听到“咔”声即可)。然后将反光镜凹面对着日光灯源翻动，翻开聚光器的光圈，将聚光器升至最高，侧面观看聚光器光明或从目镜观看视野光明即说明对光完成。将标本(标本面对上)放入载物台上的标本夹中，先用低倍镜找出标本的范围。在镜头对准的玻片部位滴一滴香柏油，转换油镜(镜头刻有一个“HI”或“oil”字或标有100×)，眼睛从镜筒侧面看油镜头，将粗调整器作顺时针或逆时针方向(取决于不同型号的显微镜)缓缓转动使镜筒下降，并使油镜头浸泡于油中，几乎与标本接触。然后用左眼看目镜，一面观看，一面认真调整微调整器使镜头提升，直到物像清楚为止。油镜用毕，应马上以擦镜纸拭去香柏油，然后再用擦镜纸沾少许二甲苯擦拭，最终用干净擦镜纸擦去二甲苯。将各物镜转成“八”字形，聚光器稍下降，以免接物镜与聚光镜相碰受损，然后放入镜箱。【留意事项】●取送显微镜时动作要轻，一只手持镜臂，一只手托镜座，防止反光镜、目镜、物镜等脱落损坏。●勿将镜臂弯曲，由于微生物学试验常常使用油镜，假设载物台倾斜，镜油易流淌外溢，影响观看或造成污染。●使用油镜时，肯定要等标本干后才能滴加香柏油，滴油时应避开气泡形成。●调焦时要特别慎重，切忌承受眼睛对着目镜边观看边下降镜筒的错误操作，以免物镜与玻片相撞，损坏镜头和压破标本。●油镜用完后肯定要擦洗，以防油干影响其使用寿命。附录使用油镜时，须加香柏油的原理(见图7)是：油镜的透镜孔很小，自标本玻片透过的光线，7理透镜，致使射入的光线较少，物象显现不清，假设在油镜与载物玻片中间参加和玻璃折射率(n=1.52)相仿的香柏油(n=1.515)，则不使通过的光线有所损失，进入透镜的光线即多，视野的亮度也就增大了。二细菌涂片(Smear)标本的制备细菌是胶体性物体，染色镜检时，必需经过轻烤脱水使菌体固定在玻片上。固定的目的是：①杀死细菌；②使菌体不易变形；③使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水洗掉；④使菌体蛋白变性易着色。【材料】脓汁标本分别菌粪便标本分别菌酒精灯接种环载玻片生理盐水8【方法】(见图8)涂片：取干净的载玻片一张，用在火焰上烧过的接种环取生理盐水1～2环于玻片上。接种环灭菌后，挑取细菌培育物少许与盐水轻轻磨匀，涂抹成直径1厘米大小的均匀薄膜。临床标本如脓汁、痰、分泌物等可直接涂片。枯燥：涂片最好在室温中自然枯燥，必要时可将涂片膜面对上，留神连续地在弱火高处略烘，以助水分蒸发，但切勿紧靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后难以检查。固定：手持玻片的一端，标本面朝上，在火焰外层快速地来回通过2～3次，共约2～3秒，使标本固定，即可进展染色。【留意事项】●涂片不行过厚，肯定要涂成薄膜。●涂片必需留意轻轻操作，假设动作过猛，可能会产生气溶胶，造成飞沫传染。●固定要适当，温度不宜过高，否则可能使细胞形态转变。三革兰氏染色法(Gram′sstain)【材料】12)9534色架吸水纸【方法】初染：在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液1～2滴，经1分钟后用细流水缓缓冲洗，并倾去玻片上余水。媒染：加芦戈氏碘液1～2滴，经1分钟后用细流水缓缓冲洗，并倾去玻片上余水。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，不易脱落。脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色或稍淡紫色为止(约需20～30秒)，马上用细流水将酒精冲掉，并倾去玻片上余水。复染：加稀释复红1～2滴，经30秒～1分钟后用细流水缓缓冲洗，并倾去玻片上余水。标本凉干后，滴加香柏油，用油镜观看，革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。【留意事项】●革兰氏染色时，关键环节是脱色。假设脱色不够，革兰氏阴性菌可被染成阳性菌；脱色过度，革兰氏阳性菌可被脱色而误认为是革兰氏阴性菌。四细菌的根本形态与特别构造的观看【材料】球菌示教片：葡萄球菌淋球菌杆菌示教片：大肠杆菌痢疾杆菌螺菌示教片：幽门螺杆菌霍乱弧菌特别构造示教片：鞭毛(伤寒杆菌)芽胞(破伤风杆菌)荚膜(肺炎链球菌)【思考题】①如何使用油镜?②革兰氏染色法的关键步骤是什么?为什么?③染色时为什么通常要用颖的细菌培育物?六细菌生化反响鉴定CharacterizationofBacteriabyBiochemicalReaction【试验目的】生疏几种常用的细菌生化反响的名称、原理、方法、结果分析及用途。把握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。【试验原理】由于细菌的种类和基因构造不同，所形成的独特酶系也不同，故对糖和蛋白质的分解力量及其代谢产物亦不一，能表现各自的特点。据此承受生化反响检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物(分解代谢和合成代谢产物)，不仅可以区分和鉴定细菌的种类，而且可以探讨细菌的生活规律、代谢机理及其与四周环境物质之间的关系。不同细菌分解糖类的力量不同，分解产物也不一样。有的细菌能分解某些糖类而产生多种酸(如乳酸、醋酸等)和气体(如H2、CO2等)，有的只产酸不产气。有的细菌不能分解某些糖。某些细菌能分解蛋白质中的胱氨酸等含巯基氨基酸，形成硫化氢。硫化氢遇醋酸铅或硫酸亚铁则形成黑褐色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。借此可帮助鉴别菌种。细菌在生长生殖过程中，还能产生一些具有鉴别意义的酶，如：幽门螺杆菌能在胃中(酸性环境)定植和生长，其中一个重要缘由是该菌产生大量的尿素pH致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔等动物血浆发生凝固，凝固的血浆沉积于菌体外表，阻碍吞噬细胞的吞噬，或即使被吞噬，也不易被杀死，从而有利于细菌生殖，引起感染。在临床微生物学检查中，血浆凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。【试验内容和方法】1(sugarfermentationtest)单糖发酵微量管是只含有一种糖(如葡萄糖、乳糖)的pH7.6的蛋白胨水，并参加肯定量的指示剂。接种细菌经培育后，假设该菌具有分解该糖的酶，有酸产生时就能使指示剂变色。如指示剂为酸性复红［pH4.2(红色)～6.2(黄色)，则变成红色；溴甲酚紫［pH5.2(黄色)～6.8(紫色)］则呈黄色。假设有气体产生，则微量管内集聚气泡。【材料】粪便标本分别菌接种针小砂轮葡萄糖发酵微量管(管底红色)乳糖发酵微量管(管底黄色)【方法】通过无菌操作，用灭菌接种针刮取细菌颖培育物少许，分别接种在葡萄糖发酵微量管和乳糖发酵微量管内。将微量管平放在平皿盖内，37℃培育过夜后观看结果。结果推断：如培育基中指示剂颜色未变时，说明细菌不分解糖，以“-”表示。如颜色改变时为细菌分解糖产酸，以“+”表示；假设同时有气泡产生时，则为细菌分解糖产酸又产气，以“”表示。【留意事项】●观看结果时，应先观看是否产气，切勿将微量管直立，以免气体溢出。二甘露醇发酵试验(mannitolfermentationtest)【材料】脓汁标本分别菌甘露醇微量管【方法】1通过无菌操作，用灭菌接种针挑取细菌颖培育物少许，接种在甘露醇微量管内。237℃培育过夜后观看结果。3结果推断：培育基中指示剂颜色转变时为细菌分解甘露醇产酸，以“+”表示，不变为阴性反响。三硫化氢试验(hydrogensulfidetest)【材料】粪便标本分别菌硫化氢微量管【方法】1通过无菌操作，用灭菌接种针挑取细菌颖培育物少许，接种在醋酸铅微量管内。237℃培育过夜后观看结果。结果推断：醋酸铅培育基中消灭黑色沉淀为阳性反响，不变为阴性反响。四尿素分解试验(urea splittingtest)细菌产生的尿素酶能分解尿素形成大量的氨，使培育基酸碱度上升而变成碱性，酚红指示剂呈现红色，是为阳性反响。【材料】粪便标本分别菌尿素微量管【方法】1通过无菌操作，用灭菌接种针挑取细菌颖培育物少许，接种在尿素微量管内。237℃培育过夜后观看结果。3结果推断：尿素培育基从黄色变为红色者为阳性反响，不变为阴性反响。五血浆凝固酶试验(coagulasetest)【材料】脓汁标本分别菌兔血浆生理盐水载玻片【方法】取干净玻片一块，用计号笔将玻片分为两格，其中一格加兔血浆1～2滴，另一格加生理1将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌冷却后，取细菌颖培育物少许，在生理盐水中研磨混匀成细菌悬液。用灭菌接种环取细菌悬液1环，或挑取细菌培育物少许，在兔血浆中轻轻磨匀。稍待片刻，观看结果。结果推断：先观看生理盐水比照，应呈均匀混浊现象。再观看细菌与兔血浆混合物，假设有凝块消灭，则为阳性；无凝块消灭为阴性。【留意事项】●兔血浆和细菌培育物要适量，以免枯燥，难以观看结果。【思考题】①细菌生化反响在感染性疾病诊断中有何重要意义?为什么?②分析本次试验的结果。如结果不佳，缘由何在?③为保证明验结果的牢靠性，你认为上述试验应还设立哪些比照?七细菌血清学反响鉴定CharacterizationofBacteriabySerologicalReaction【试验目的】把握玻片凝集试验的原理、方法、结果观看与推断。生疏肥达氏反响的原理、方法、结果推断和分析。【试验原理】血清学反响是指抗原抗体在体外的特异性结合反响，可用抗原检测未知抗体或用抗体检测未知抗原。常见的有凝集反响、沉淀反响、补体结合反响和中和反响等。血清学反响常用于传染病的诊断和微生物菌株的鉴定。将的抗体(诊断血清)直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌)混合，在有适当电解质存在条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物消灭，即为阴性，称为直接凝集反响，属定性试验，有玻片法和试管法两种，主要用于检测抗原，如菌种的鉴定与分型、ABO用各种标准的伤寒杆菌H、O抗原和甲型副伤寒H抗原、乙型副伤寒杆菌H抗原与病人不同稀释倍数的血清做定量凝集试验，称为肥达氏反响，可用于测定患者血清中相应抗体的含量及其增减状况，以关心肠热症(伤寒和副伤寒)的诊断。【试验内容和方法】一玻片凝集试验(slideagglutinationtest)【材料】载玻片诊断血清粪便标本分别菌【方法】取干净载玻片二张，用计号笔将玻片分为两格，分别参加大肠杆菌诊断血清、痢疾杆菌1～2将接种环烧灼灭菌、冷却后，取细菌培育物少许，分别在4种诊断血清中研磨混匀，接种环作灭菌处理前方可放下。如上述混合悬液由均匀混浊变为澄清透亮，并消灭大小不等的乳白色凝集块者即为阳性；如混合物仍呈均匀混浊则为阴性。如肉眼观看不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜观看。一般可马上消灭凝集现象，如结果不明显，可转动玻片数次。2～3分钟仍不消灭凝集者，可认为阴性。观看完毕，将载玻片马上放入指定的消毒缸内(为什么?)【留意事项】●诊断血清和细菌培育物比例要适量，以免枯燥，来不及观看结果。●每一菌株应同时作生理盐水比照，防止误将细菌自凝现象认为凝集反响。二肥达氏反响(widaltest)【材料】病人血清甲型副伤寒杆菌“H”菌液乙型副伤寒杆菌“H”菌液伤寒杆菌“H”菌液与“O”菌液试管吸管吸头生理盐水37℃水浴箱【方法】2847在中试管参加生理盐水3.8ml，再换一支吸管，吸取患者血清(须先经56℃，30分钟灭活)0.2ml31∶20)。1∶202ml10.5ml。吸生理盐水2ml，参加到上述中试管中，与余下的2ml1∶20的血清混匀，即稀释成1∶40。然后吸取2ml1∶40的血清，向每排第2管中各参加0.5ml。按上法将血清不断做倍比稀释，并依次参加各管，直至每排第6管止。各排第7管不加血清，各参加生理盐水0.5ml作为比照。依7、6、5……1管的挨次，参加菌液：第1排各管中参加伤寒杆菌“H”菌液0.5ml。第2排各管中参加伤寒杆菌“O”菌液0.5ml。第3排各管中参加甲型副伤寒杆菌“H”菌液0.5ml。第4排各管中参加乙型副伤寒杆菌“H”菌液0.5ml。这时每排各管中血清的最终稀释度如下：试管序号〖〗1〖〗2〖〗3〖〗4〖〗5〖〗6〖〗7血清稀释度〖〗1∶40〖〗1∶80〖〗1∶160〖〗1∶320〖〗1∶640〖〗1∶1280〖〗——将各管中悬液混匀，置37℃水浴箱中2小时，取出置室温过夜，次日观看结果。附：结果推断与分析先看各排比照管，应无凝集，悬液仍旧均匀混浊，或仅有极少量菌体沉于管底呈一集中的小点；伤寒杆菌“H”抗原、甲型和乙型副伤寒杆菌“H”抗原与相应抗体的凝集块呈絮状疏松，沉于管底，轻摇时沉淀物极易浮起，且易裂开；伤寒杆菌“O”抗原的凝集较严密，呈颗粒状沉于管底。依据凝集反响的强弱，分别以、、、＋记录之。：液体清彻透亮，菌体全部被凝成块，沉于管底。：液体较透亮，菌体大局部被凝集而沉于管底。：液体稍透亮，管底有少量凝集沉淀物。＋：液体较混浊，可见极少量凝集沉淀物。-：液体的混浊度及管底沉淀物与比照管相像，无沉淀。一般以消灭凝集的血清最高稀释倍数作为该血清对某抗原的凝集效价。在分析结果时，首先应考虑当地正常人效价。一般以单份血清凝集效价：伤寒O应达1∶80以H1∶160以上，甲型和乙型副伤寒H1∶80以上才有诊断价值。假设其次次血4【思考题】1、血浆凝固酶试验和玻片凝集试验观看完毕，应将载玻片马上放入消毒缸内，为什么?2、依据试验结果，试分析标本中可能有何种细菌，为什么?八细菌药物敏感性试验TestofSusceptibilityofBacteriatoDrug【试验目的】生疏药物敏感性试验方法的种类、原理及应用。把握纸片集中法。【试验原理】自从抗生素、磺胺类等抗菌药物广泛应用以来，致病菌对这些药物产生耐药性的状况日益增多，并以金黄色葡萄球菌、结核杆菌、痢疾杆菌、铜绿色假单胞菌、大肠杆菌等尤为突出。细菌耐药性变异，是临床工作中必需留意的问题。为了防止细菌产生耐药性和确保治疗效果，在用抗生素治疗前，应做细菌药物敏感性试验，选用敏感的药物进展治疗，避开为耐药性突变的菌株供给选择和进展的条件，这就要求细菌学工作者必需保证药敏试验结果高度准确性。细菌对抗生素敏感性试验方法有：液体稀释法：在试管中参加肯定量适于测试菌生长的液体培育基作为稀释液，将不同剂量的药物参加各管中，使形成一组含不同递减浓度的药物试管，然后逐管参加肯定量的测试菌，在适宜温度下培育肯定时间后，用肉眼观看其混浊度或用光电比色计作比浊测定，以不MIC；琼脂稀释法：将不同剂量的药物与肯定量溶化的固体培育基相混合，制成含不同递减浓度的药物平板，然后将肯定量的测试菌接种于含药平板上，在适宜温度下培育肯定时间后，MIC；纸片集中法：是利用抗生素在琼脂培育基的集中渗透作用，将含浓度的药物滤纸片贴于含有敏感性试验菌的琼脂培育基外表，抗生素就自纸片向平板四周集中渗透，在抑菌浓度所达范围内敏感菌的生长被抑制而消灭抑菌圈，通过比较抗生素浓度与抑菌圈的大小以测定抗生素的抑菌浓度。细菌药敏试验中所用的特地名词解释如下：最低抑菌浓度(MinimalInhibitoryConcentration,MIC)：抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。最低杀菌浓度(MinimalBacteriacidieConcentration,MBC)：抗菌药物杀灭细菌所需要的最低浓度。敏感(Sensitive)：常用量预期有效。中度敏感(Moderatesensitive)：常用量体内药物浓度较高的部位或超常用量增加血中药物浓度预期有效。耐药(Resistant)：常用量预期无效。病原菌对某种抗菌药物敏感、中度敏感和耐药的分界点是依据该菌在血中的治疗浓度和病原菌对该药物的最小抑菌浓度而确定的。【试验内容和方法】一纸片琼脂集中法(KirbyBauermethod)本法快速、简便，已为多数临床细菌学试验室所承受。【材料】脓汁标本病原菌粪便标本病原菌Muller Hinton琼脂平板肉汤培育基青霉素、链霉素、庆大霉素和生理盐水滤纸片尺9验图型【方法】培育基制备MH琼脂(pH7.2～7.4)倾注入直径9cm平皿中，厚4mm。临用时，半开盖平板，倒置于35℃培育箱10～20分钟使外表枯燥。链球菌或其他较难生长的细菌可在上述5%无菌脱纤维羊血。被检菌液的制备挑取单菌落4～5个，接种于4～5ml肉汤培育354～6时，使菌液到达或超过1.5×108/ml麦氏比浊管浓度。参加灭菌盐水，使其浓度与标准管全都。接种制备好的接种菌液必需在15分钟内使用。用无菌棉拭沾取颖菌液，涂布接种于MH琼脂外表，重复三次，每次将平板旋转60度，保证菌液均匀分布。盖好平皿，放置5分钟，待平板外表水分被琼脂完全吸取。贴抗菌纸片用无菌眼科镊子夹取抗生素滤纸片(直径为6.35mm20μl)，分别贴在平板上。用镊尖压一下，使其贴平。各滤纸片之间距离应根本相等(不少于24cm)，纸片中心距平皿边缘约15mm。在平板底面上做好标记。在15分钟内将平板置35℃培育18～24结果推断如细菌对药物敏感，则含该药物的滤纸片四周无菌生长。无菌生长的区域称抑菌环。如细菌对该药物具有耐性，则无抑菌环或抑菌环直径较小。记录并比较抑菌环直径大小，推断细菌的敏感性。同时接种质(量)控(制)菌株作为阳性比照。K B法质控用菌株常规有三种，分别是金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。生理盐水纸片作为阴性比照。常用药敏试验纸片推断标准抗菌药物〖〗纸片含药量〖〗抑菌圈直径(mm)〖〗耐药中度敏感敏感青霉素G(葡萄球菌)〖〗10单位〖〗≤28〖〗-〖〗≥29链霉素〖〗1011〖〗12-14〖〗≥15庆大霉素〖〗10微克〖〗≤12〖〗13-14〖〗≥15四环素〖〗3014〖〗15-18〖〗≥19【留意事项】●购取抗生素滤纸片因产地不同，纸片含药量也可能不同，因此在推断结果时应留意参照标准。●结果的读取应首先测量质控菌株的抑菌环直径，如在允许范围内，被检菌结果才可信。二琼脂平板稀释法(agardilutionmethod)琼脂平板稀释法药敏试验的优点：(1)比液体稀释法重复性好；(2)可同时检测多种被检菌；(3)可觉察混合菌和污染菌；(4)可观看菌落生长良好与否。因此，WHO推举此法为细菌药敏试验最正确方法。【方法】制备含不同浓度抗菌药物养分琼脂平板，当琼脂温度在50℃左右时参加抗菌药物，温度过高，抗菌药物受破坏，温度过低则药物不能混匀。接种颖菌液。用接种环接种5～8mm圆形区，MIC335℃培育18～24小时后，以完全抑制细菌生长的最低药物浓度为被检菌的MIC，薄层极微弱生长或只生长1～2个菌落可无视。阳性比照(不含抗菌药物)培育基应消灭接近融合生长。附：药敏自动化检测系统目前有MIC 2023，MS 2，CobasBact和VitekAMS等。这些仪器根本原理是利用光学手段监测细菌增殖的程度。以只含菌不含药的小管(或小凹)内的光学浊度(或透亮度)的增长程度与含药和细菌的小管(或小凹)内的细菌增殖程度，比照推断敏感(S)、中度敏感(MS)或耐药(R)。一般而言，自动化检测仪主要优点是可快速(约4～5小时)获得药敏结果，且可同时测十多种抗菌药物，临床医师可准时选用有效治疗药物，缩短住院日期，降低医药费用。但不管哪种自动化检测仪均不能完全代替WHOVitekAMS与KB95～98%，CobasBact与KB88.1～90.1%。特别值得留意的是，自动化检测仪不能检出某些异型耐药菌株，有时误将耐药报告为敏感。AMS也不能觉察污染菌株，可能将敏感报成耐药。而KBAMSSXTKB【思考题】1、抗生素敏感性试验有何实际意义?2、报告纸片法试验结果，是否符合你所鉴定的细菌的药敏特性?3、细菌药物敏感试验要设立哪些比照?为什么要设立这些比照?九.细菌的动物感染与致病性试验AnimalInfectionAndPathogenicityTestsofBacteria【试验目的】把握细菌动物感染的常用方法。了解感染动物的细菌学检查原则。了解细菌外毒素和内毒素测定的原理和方法。【试验原理】为了证明人类的某特定感染性疾病是由特定病原菌引起的，必需实行Koch准则的全部步骤，即：①在同一特定疾病的机体中常能觉察同一种病原菌；②能从患病机体中分别出这种病原菌，并获得纯培育；③将这种培育物接种到易感动物体，应能引起一样的疾病；④能从感染的试验动物中重分别出与原接种菌一样的病原菌，并获得纯培育。这或许需要在人身上进展某些不合道德的、而又迫不得已的科学试验。但是，并不是在全部情形下都有可能实行这些步骤，如不宜在人体中做鼠疫杆菌感染试验。因此，通常需要在动物体中进展微生物感染试验。细菌的动物感染应用格外广泛，如：①细菌的鉴别和诊断；②细菌致病物质和致病机理的研究；③考察抗菌药物和生物制品的疗效；④制备各种免疫血清及抗毒素。不同的细菌对动物的易感性不一，感染的途径也不一，因此，在进展细菌的动物感染时应选择易感动物，确定适当的感染途径，严格执行无菌操作。常用的试验动物有小鼠、豚鼠、家兔等。为使动物试验正确、牢靠，必需按试验要求，选择动物种、系及体质安康，生长发育良好，肯定的体重和年龄，具有高度敏感(或易感)性，且饲养治理比较便利的动物。病原菌突破机体的屏障构造并定居于某组织后，能适应机体生化环境进展生长生殖，其中大多数细菌能产生毒性酶(如血浆凝固酶、透亮质酸酶)，构成细菌的侵袭力，同时合成和释放毒素(内毒素和外毒素)，引起宿主的损伤而致病。【试验内容和方法】一动物的试验感染方法与感染动物的细菌学检查(infectingmethodofexperimentalanimalandbacterialexaminationofinfectedanimal)依据病原菌不同，可承受不同的接种法，如腹腔内注射、静脉内注射、皮下注射、脑内接种、眼角膜接种、肌肉注射和喂饲接种法等。【材料】小白鼠肺炎球菌菌液无菌注射器及针头碘酒、酒精棉球【方法】1、用无菌注射器以无菌操作要求吸取肺炎球菌菌液，吸取量稍多于使用量，注射器内不能有气泡，故吸入菌液后应将注射器针头朝上，在针头上裹以消毒棉花，使气泡上升，然后轻轻推出，避开菌液四溅，特别留意防止眼结膜感染。2、用右手轻轻拖鼠尾，使其爬行于粗物外表上再以左手拇、食两指抓紧小白鼠两耳及其颈项皮肤，使鼠体被固定在左手掌间，以左手无名指或小指夹住鼠尾及左后腿，然后用碘酒消毒腹壁皮肤。3、左手倾斜，使小白鼠头部稍向下，将预先预备的菌液注入腹腔内，注射时右手持已吸有菌液的注射器，针尖自小鼠左侧腹股沟处刺穿皮肤，使针尖在皮下组织内向前移行约1厘米左右，然后再轻轻向下刺进腹腔，抽吸注射器，如无回血或尿液，表示针头未刺入肝、膀胱等脏器，即可注射。4、接种完毕，将小白鼠标以记号，置入鼠罐中，并填写动物试验记录卡或标签，注明试验动物名称、编号、注射材料、部位、剂量以及注射日期，然后将卡片挂在动物容器上。5、感染动物予以隔离喂养，并逐日观看，留意有无发病病症，如食欲不振，竖毛，不活泼等现象，并加以记录，必要时定期测量体重及体温，假设有致死可能，务必在动物濒死前准时杀死，作病原学分别与病原学检查。6、试验动物或患病动物的细菌检查应依据病原菌不同，采集不同的标本，如血、尿、粪便、内脏等。对待检标本，可进展直接涂片、染色镜检，或进展细菌的分别培育与鉴定。二透亮质酸酶试验(spreadingtestofhyaluronidase)透亮质酸酶，又称集中因子，能溶解机体结缔组织中的透亮质酸，使组织疏松，通透性增加，使病菌易在组织中集中、病灶扩大。【材料】家兔碘酒、酒精棉球无菌注射器墨汁(或美兰)溶血性链球菌培育物(或透亮质酸酶溶液)生理盐水。【方法】取家兔一只，将其背部两侧毛剪去，用碘酒、酒精消毒。用注射器吸取0.1ml墨汁(或美兰)和0.1ml溶血性链球菌培育物(或含透亮质酸酶600单位的溶液)，注射一侧皮内。于另一侧背部皮内注射0.1ml墨汁和0.1ml生理盐水，作为比照。注射后1小时后观看结果，比较两侧墨汁集中范围的大小。三内毒素的致热试验(feveractionofendotoxin)内毒素具有多种生物学活性，主要毒性作用有发热反响、白细胞反响、休克等。将含内毒素的细菌培育物注入动物体内，由于内毒素的毒性作用，动物可表现出这些病症。【材料】家兔内毒素(伤寒杆菌培育滤液)半导体点温度计无菌注射器碘酒、酒精棉球【方法】注射内毒素前，用半导体测温计固定测量家兔耳内凹处皮肤体温，并记录结果。以手指轻弹兔耳，去毛，压迫耳根部静脉，使耳外缘部静脉充血而怒张，然后先用碘酒，再用酒精消毒，用无菌注射器吸取内毒素0.5ml，注入兔耳静脉内。30.5ml，作为比照。4注射后，每间隔20分钟测量一次体温，直至2小时为止，并记录结果，观看是否体温上升。四破伤风外毒素的毒性作用试验(toxicactionofTetanusexotoxin)破伤风杆菌外毒素(痉挛毒素)是一种神经毒素，对脑干神经和脊髓前角神经细胞有高度亲和性，以毒害中枢神经系统为主，有导致肌肉强直性痉挛等一系列表现。【方法】取安康小白鼠二只，将其后腿用碘酒、酒精消毒后，一只经肌肉注射破伤风杆菌培育滤液(含破伤风外毒素)0.1ml；另一只注射肉汤培育基0.1ml作比照，分别将二只小白鼠放入已标记好的鼠缸内。填写动物试验记录卡片，注明试验动物名称、记号、注射材料、部位、剂量以及注射日期等，然后贴于鼠笼上。每隔2小时观看一次。小白鼠尾巴强直，注射毒素侧的下肢麻痹，呈强直性痉挛，随着时间的延长，病症渐渐加剧，并可见全身肌肉痉挛、角弓反张等现象，1～2日内小白鼠死亡。比照小白鼠无特别表现。【思考题】请设计一个破伤风抗毒素中和作用的试验方案。十微生物快速诊断技术自1876年Koch创用固体培育法分别培育细菌以来迄今的百余年中，微生物诊断技术的进展大体可分为三个阶段。第一阶段在纯培育的概念指导下进展起来的常规微生物学诊断技术，主要包括病原体的显微镜检查、分别培育、生化反响鉴定、血清学反响鉴定及动物试验等技术。这些技术所需检样量大，耗用药品器械多，一般要数天才能出结果，因而不能满足临床诊断和治疗的需要。进入本世纪以来，很多微生物学工作者试图转变这种状况，努力向简洁、快速的目标迈进，取得了一些进展，但始终摆脱不了纯培育概念的束缚。其次阶段自本世纪七十年月以来，随着物理学、化学和免疫学的进展而建立起来的分析微生物学技术及免疫学技术，使微生物学诊断技术摆脱了纯培育的概念，打破了常规微生物学诊断的旧框框，绕过了繁琐的纯培育操作，直接对标本进展检测，在几小时甚至几格外钟内获得结果，使微生物的快速诊断成为可能，到达对传染病进展早期诊断、治疗效果评价及预后推断之目的。分析微生物学技术主要包括，气相色谱技术、电阻抗测量技术、放射测量技术和发光技术等。用于微生物快速诊断的免疫学技术常用的有免疫荧光技术、免疫酶联技术、放射免疫技术和对流免疫电泳技术等。第三阶段近十几年来，由于分子生物学的进展而建立起来的用于检测病原体核酸和蛋白质的分子生物学技术，如核酸探针诊断技术及聚合酶链反响技术等，使病原体的鉴定不再局限于其外部形态构造及生理特性等一般性质的检验上，而是站在分子水平的高度，检测病原体内部的生物大分子(蛋白质、核酸)构造。这些技术具有简便、快速、微量、特异等优点，有着宽阔的应用和进展前景。以下就API鉴定系统及分子生物学技术作一简洁介绍：API长期以来，我国临床微生物学试验室始终沿用100多年前由革兰、巴斯德、科赫及皮特里等制造的传统的细菌学鉴定方法。但在今日看来，传统的鉴定方法不仅过程繁琐，费时费力，且在结果的推断上易发生主观片面，难以进展质量掌握。随着微生物感染类型的转变，型病原菌的种、属不断增加，因此，临床上迫切需要建立快速、准确的细菌鉴定方法。本世纪70年月诞生的微生物数码分类鉴定法集数学、电子、信息及自动分析技术于一体，可将菌科鉴定到属、群、种和亚种或生物型，以依据不同来源的临床标本进展有针对性的鉴定。该法目前已在世界范围内广泛应用，具有标准化、商品化、简易化、微量化、快速化和系统化等优点。在众多的细菌快速鉴定系统(API、Minitek、Enterotube、Micro ID)之中，API(AnlyticProductsINc)系统是目前世界上应用最广、种类最多的系统。依据待鉴定的细菌种类的不同API系统设计了不同的工程与底物组合，可分为四类：快速鉴定系统；特定菌属(群)的鉴定系统；3ATB(AutomaticTestingBacteriology)4用于争论细菌对糖的发酵、氧化和同化力量以及细菌所具有的酶谱。使用生化反响谱索引时，必需先将生化反响所得阳性或阴性结果转换成数码，并与索引手册中数码相比较。编码的原则是将全部的20(或32)个生化反响，加上接触酶和3个形态特征，即是否产生芽胞、革兰氏染色和菌体形态是否球状，从阳性到阴性的信息浓缩成一组数字。具体用法是每三个反响为一组，每组内按其位置，第一位阳性为1，其次位阳性为2，第三位阳性为4，阴性反响时均为0，每个组内数之和就可能为0、1、2、3、4、5、6、7。如此可将API系列试验条测定，组成一个八位或十位的数字。其数值举例如下：基萄质素糖〖〗甘乳蔗露醇糖糖〖〗麦水木芽杨糖素糖〖〗阿明七拉伯叶糖胶灵〖〗甘纤甘维二露油糖糖〖〗松棉山三子梨糖糖醇〖〗鼠海触李藻糖糖酶〖〗芽革细兰胞氏形染胞色态①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④4〖〗1〖〗0〖〗2〖〗6〖〗1〖〗0〖〗3这株菌的数值编码为41026103，依据数值编码检索，即可查出此菌的菌属和菌种名称，该菌为困难梭菌。从数值编码检索表中查出哪类群菌属种名称，同时依据鉴定概率(%id)对鉴定的可信度作出评价：%id≥99.9最正确的鉴定可信%id99.0～99.8很好的鉴定%id90.0～98.9%id80.0～89.9假设%id过低时，应按补充试验进一步鉴定。从数值编码检索表中查不出类群，可以考虑以下可能：①编码的菌是极不典型的；②概率小，不能承受的鉴定；③可疑的鉴定或种。API试剂条由高质量透亮塑料制成，便于观看结果，有20个小管式反响杯，内含枯燥生化基质液，常用的生化反响有五类：发酵试验为碳水化合物与酸的分解代谢试验，反响结果通过pH值的变化而引起指示剂颜色的转变。同化试验将待测菌分别培育于含各种基质的培育基中，依据其能否利用其中的单一碳水化合物作为碳源而得以生长以帮助鉴定，是一种生长试验。同化或发酵抑制试验为生长抑制试验，待测菌如遇到对其有毒的化合物就不能生长或不消灭相应的反响，据此可帮助鉴定。4.酶试验为分解某些合成底物的化学反响，如待测菌含有相应的酶就可分解底物自发显色或经添加试剂后显色。操作程序分预备、接种、观看并记录结果三个阶段。一、预备标本处理必要时使用运送培育基及进展细菌的分别培育等。预试验如革兰氏染色、镜检等。菌落的选择选择可疑致病菌的特征性菌落。二、接种制备细菌悬液挑取1个或多个菌落按不同要求用蒸馏水或生理盐水制备细菌悬液。接种的浓度依据试剂条的要求制备约1.5亿/ml的细菌悬液。接种的体积有以下三种要求：(1)试验名称下无任何标记的小孔，参加细菌悬液至“半满”，小管满而小杯空。(2)如试验名称加有方框，则加菌液至平满，小管和小杯皆满。(3)如试验名称下有一条横线，表示需加液体石蜡，应加菌液至半满后在小杯内加液体石蜡。三、观看及记录结果接种后的API试条一般经35～37℃培育18～24小时可观看结果。观看方法有三种(见下表)：自发反响可用肉眼直接观看颜色变化，多数试验属于此种；需添加试剂的反响有些试验需添加不同的试剂前方消灭颜色变化；荧光反响有些试验需在紫外灯下观看荧光现象。API20A测定〖〗底物〖〗反响/酶〖〗结果阴性〖〗阳性Ind12～31滴Ehr试剂。试验必需浮在二甲苯/石蜡油上。5分钟之内读结果黄色〖〗红色Ure〖〗尿素〖〗尿素酶〖〗黄—橙色〖〗红色GluLac〖〗乳糖Sac〖〗蔗糖〖〗产