一种去除RNA样本中rRNA的方法与流程

一种去除RNA样本中rRNA的方法与流程背景介绍在进行转录组学分析的时候，我们需要分离出mRNA，并去除RNA样本中的rRNA，因为rRNA占据了大部分的RNA样本量，如果不去除rRNA，会对后续的转录组学分析产生干扰。因此，去除RNA样本中的rRNA是转录组学数据准确性的关键步骤之一。目前主要的去除rRNA方法Poly(A)选择法Poly(A)选择法是一种广泛使用的去除rRNA的方法。基本原理是利用rRNA不带有Poly(A)尾巴的特点，通过Oligo(dT)亲和层析材料选择出Poly(A)尾部带有Poly(A)尾巴的mRNA，从而在RNA样品中去除了rRNA。缺点是可能有rRNA也带有Poly(A)尾巴，所以仍然会有一定程度的rRNA污染。rRNA特异性杂交寡核苷酸去除法把rRNA与某种特异性杂交寡核苷酸探针结合，从RNA混合物中抽取所有rRNA，一种非常有效的去除rRNA方法。其优点是能够特异性去除rRNA，缺点是可能会有一些非特异性的杂交发生。碱基对互补杂交法这种方法是利用小片段RNA的碱基序列与rRNA互补配对来形成RNA-RNA双链，形成双链结构后，采用RNA酶H切割RNA区域，从而去除rRNA。这种方法能有效地去除rRNA，但也有一定程度的非特异性去除其他RNA问题。序列捕获法序列捕获法是一种高通量的去除rRNA方法。基于序列互补的思想，序列捕获是一种针对rRNA的高效去除方法，通过合成一些特定的rRNA探针，在靶RNA中寻找相应的序列，并将其裁剪掉。该方法可以特异性地选择性地去除rRNA。本文介绍一种修改版的rRNA去除方法和流程实验前的准备核酸分离柱（如RNAClean&ConcentratorTM-5）rRNA去除试剂盒（如Ribo-ZeroTMrRNARemovalKit）10%聚丙烯酰胺凝胶（theBio-RadCriterionTXCPrecastGel）电泳开发剂（theBio-RadElectrophoresis1XMOPSRunningBuffer）分子生物学级水（如UltraPureTMDNase/RNase-FreeDistilledWater）样品制备从细胞培养物或组织中提取总RNA。将总RNA通过核酸分离柱纯化，去除蛋白质、DNA和其他残余物质。rRNA去除过程在脱除rRNA反应中添加rRNA去除试剂盒中的试剂，然后与总RNA混合，室温下反应15分钟。使用磁珠来去除富集的rRNA。将寡核苷酸探针加入RNA样品中，进行杂交反应。用Dynabeads进行寡核苷酸-寡核苷酸杂交后的产物分离。在3000r/min的旋转速度下离心，在聚丙烯酰胺凝胶上运行电泳。实验后处理在上一步中，RNA被经过核酸分离柱处理过的转录组应用级水溶解后加入聚丙烯酰胺凝胶中。在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以去除剩余的rRNA。研磨凝胶进行乙酸铊染色并用分峰器分离RNA。结论rRNA去除是转录组学分析中的重要步骤，目前存在许多可用的方法。本文介绍了一种修改版的rRNA去除方法，该方法比传统的P