神经生物学的常用研究方法课件

大家好大家好1五、神经生物学常用的研究方法（一）形态学方法（二）生理药理学方法（三）生物化学方法（四）电生理学方法（五）分子生物学方法（六）脑成像（Brainimaging）技术五、神经生物学常用的研究方法（一）形态学方法2（一）形态学方法1、束路追踪法2、免疫组织化学法3、原位杂交法4、受体定位法（一）形态学方法1、束路追踪法3束路追踪法研究神经元之间的纤维联系是神经科学研究领域的一个基本问题，其研究方法主要有三：（1）利用神经元轴浆运输现象的追踪法，是目前应用最广者；（2）利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法；（3）利用某些荧光染料在神经细胞质膜扩散的神经元质膜荧光追踪法。束路追踪法研究神经元之间的纤维联系4（1）轴浆运输追踪法轴浆运输：神经元有长短不等的轴突，由于轴突内缺乏参与蛋白质合成的核糖体，所以需要从细胞体不断地将各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至胞体。不同物质的运输速度不同。顺行运输：从胞体向轴突及其终末的运输。逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。（1）轴浆运输追踪法5常用方法：a辣根过氧化物酶追踪法1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）可被神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技术，即HRP法。HRP即可作逆行追踪剂使用，也可作顺行追踪剂使用。基本步骤：将HRP注射至实验动物中枢核团或周围器官、神经的一定部位；存活一定时间后灌注、固定动物，取材作冰冻切片；然后用双氧水（H2O2）及呈色剂四甲基联苯胺（TMD）或二氨基联苯胺（DAB）显示HRP反应产物。

常用方法：6将HRP注射于周围神经感觉末梢或神经干逆向标记背根神经节细胞后，HRP还可进一步沿背根节细胞的中枢突顺向标记其在脊髓的中枢终止部位，称作跨节标记。将HRP注射于周围神经感觉末梢7HRP：1.游离HRP：通过非特异性整体胞饮的方式被摄入2.结合HRP：通过与细胞膜的特异性受体结合的介导进入神经元麦芽凝集素（WGA）-HRP霍乱毒素（CT）-HRP优点：灵敏度高，用量较少，HRP在胞内降解时间明显延长，能清晰地显示包括细微分支在内的整个神经元的全貌。注意：因为HRP到达预定部位的时间取决于运输速度和距离，运输速度因动物及纤维种类而异。同时HRP被运至胞体后即被送入溶酶体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过程中求得最佳存活期必须具体测试。呈色剂：1.二氨基联苯胺(DAB):DAB作为供氢体，HRP在H2O2存在的情况下，能使DAB发生氧化，生成不溶性棕褐色反应产物沉淀，定位在抗原所在处。2.二盐酸联苯胺(BDHC)3.邻-联茴香胺(OD)4.四甲基联苯胺(TMB)用途：研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组织化学、电镜技术等结合。HRP：1.游离HRP：8HRPlabellingneuronsinoculomotornucleusofcat10×40×HRPlabellingneuronsinoculo9HRPlabellingneuronsindLGN40×HRPlabellingneuronsindLGN410b荧光素追踪法-主要作逆向追踪1977年，荷兰著名神经解剖学家Kuypers及其同事首先发现部分荧光化合物可被神经纤维的末梢摄取，并通过轴浆流逆行运输到各自的神经元胞体，切片后在荧光显微镜下可直接观察到这些胞体的定位，从而建立了研究神经纤维联系的荧光素逆行追踪法。原理：将荧光物质注射至神经元的轴突分布区,经分支的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜下可看到胞体内呈现荧光标记物。

b荧光素追踪法-主要作逆向追踪11荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些荧光素发出的荧光颜色各异。不同荧光素在神经元内的标记特征不同：绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢，甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用），fastbule（固蓝）等。只有少数仅标记细胞核，如nuclearyellow（核黄）,diamidinoyellow（双脒基黄）等。荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定发射波长发12

FastbluelabellingneuronsDRGSpinalcord20×20×Fastbluelabelling13FastBlueLadellingGanglionCellsofRetina

20×FastBlue20×14优点：可靠性，灵敏性，

利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。

双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团或区域。需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。缺点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时间也有限。应用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化学结合，研究投射神经元的化学性质。优点：可靠性，灵敏性，15（2）变性束路追踪法利用神经元的轴突被损伤之后，在损伤的近侧端和远侧端分别发生逆行和顺行溃变；神经元胞体受损后，其发出的轴突从胞体向终末方向的远侧端发生顺行溃变，来研究纤维的联系。（2）变性束路追踪法16损伤手段：物理性方法锐器的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等特点：无选择性，除了损伤神经元和发出的纤维以外，也能破坏通过此损伤部位的纤维，导致非特异性标记。化学性破坏单胺类神经毒剂：6-羟多巴胺（可选择性被儿茶酚胺类神经元摄入，经过自氧化形成若干具有细胞毒性的产物。由于整个神经元的细胞膜均可摄入6-羟多巴胺，故儿茶酚胺类神经元的任何部位都可被6-羟多巴胺破坏。不易通过血脑屏障，因此如欲造成中枢性破坏，需做脑室或脑内注射）、6-羟多巴、5,6-双羟色胺和5,7-双羟色胺（选择性破坏5-羟色胺能神经元）胆碱类神经毒剂：乙基胆碱氮芥丙啶正离子兴奋性氨基酸：海人酸和鹅高蕈氨酸（能够非选择性损伤神经元的胞体，而不损伤轴突，故无过路纤维受损问题）损伤手段：17研究方法：

20世纪从40年代，镀银染色法，根据银染溃变纤维的形态变化来判断、追踪溃变纤维的方法。20世纪从50年代，Nauta法，一种改进的溃变镀银法，能抑制正常纤维的染色而仅染出溃变纤维。20世纪70年代，变性束路追踪法逐渐被轴浆运输追踪法所代替。可与逆行标记法、顺行标记法、免疫组织化学、原位杂交等技术结合运用。研究方法：18（3）神经元质膜荧光染色法这类染料是利用它们能溶于细胞膜脂层内并在膜内扩散的特点。可用在活体或固定的标本上追踪纤维联系。这类染料中DiI、DiA和DiO最常用。主要优点是可用于固定标本，一些难以在活体注射的小核团在固定标本上常比较容易做到。缺点是其在膜内扩散的速度很慢，而且有效距离比较短，因此最适用于胚胎或小动物。（3）神经元质膜荧光染色法这类染料是利用它们能溶于细胞膜脂层19免疫组织（细胞）化学法20世纪70年代，免疫组织化学技术被引入脑研究领域，它以特异性强、灵敏度高的特点，使神经元内所含的神经活性物质、受体和转运体可视化，给形态学研究开辟了新的途径。免疫组织（细胞）化学法20世纪70年代，20基本原理

利用免疫学中抗原与抗体特异性结合的特点以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入特定的标记抗体，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量研究。免疫酶技术显示Caspase-3免疫荧光技术显示MOR基本原理免疫酶技术显示Caspase-3免疫荧光技术显示MO21因为抗原与抗体的结合是高度特异的，所以免疫组织化学方法具有高度的特异性、灵敏性和精确性。免疫组织化学的抗原通常是肽或蛋白，有数量不等的抗原决定簇。抗原决定簇由暴露于抗原表面、在空间上相邻的3-8个氨基酸组成。一个抗原上可以有多个抗原决定簇。故由此而产生的抗血清中可能含有针对不同决定簇的多克隆抗体。用杂交瘤技术可以制成针对单个决定簇的单克隆抗体。抗体仅识别特定的抗原决定簇，而不识别抗原本身，因此不同物质只要有相同的抗原决定簇，均可被同一抗体识别，所以在免疫组织化学法中应注意抗体的特异性及交叉反应。因为抗原与抗体的结合是高度特异的，所以免疫组织化学方法具有高22

抗体（antibody,Ab）机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B细胞——浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。是介导体液免疫的重要效应分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由两条相同的重链（heavychain,H）和两条相同的轻链（lightchain,L）借二硫键连接而成。在氨基端，重链的1/4和轻链的1/2氨基酸序列变化很大，为可变区（variableregion,V）；其他部分氨基酸序列相对恒定，为恒定区（constantregion,C）。

23Fab即抗原结合片段（fragmentantigenbinding），由一条完整的轻链和部分重链（VH和CH1）组成。该片段具有单价抗体活性，能与一个相应的抗原决定族特异性结合。Fc即可结晶片段（fragmentcrystalline），Fc段含有两条重链C端的一半，包含CH2和CH3两个功能区，它无抗体活性。Ig在异种间免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同时Fc段还具有活化补体、亲细胞、通过胎盘和介导与细菌蛋白结合等生物学活性。用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为两个完全相同的Fab和一个Fc片段。Fab即抗原结合片段（fragmentantigenbi24多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb）大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。PcAb特异性差，易出现交叉反应。多克隆抗体25由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、易大量制备。制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单一表位的浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。

单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具26组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞（组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位和定量分析。酶组织化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色变化，其次对该酶进行定位、定量分析。组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间27

在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及定位和定量以及代谢状态时，需要满足以下要求：保持组织和细胞形态结构的良好状态，以便反应产物的定位精确。如果形态结构破坏而失真，则定位困难。

具备一定的特异性，以便获取正确的实验结果。具备一定的灵敏性，以便含量极微的物质也能被显示出来。

生成的反应产物必须是有色沉淀，颗粒微细不溶，定位于原位。反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系。反应产物具有稳定性，以便于重复观察要有重复性。

选择的试剂必须是分析纯，对被检测物质或酶应无任何影响；实验所用器皿必须清洁无污染杂质，使用的蒸馏水应为双蒸水。为了保证实验的可靠性、科学性，防止假阳性的发生，必须同时作对照实验。在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及定位和28免疫组织化学的技术分类根据Ag—Ab结合方式分成：①直接法②间接法③多层法根据染色方式分成：贴片染色漂浮染色免疫组织化学的技术分类29按标记物的性质分成：免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）标记物必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。所以需要用标记的方法将某种标记物（如酶、荧光素）结合到抗体上，再用组织化学方法显示此标记物或在荧光显微镜下观察荧光素发出的荧光。神经生物学的常用研究方法课件30常用标记物①荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate,FITC）——荧光显微镜下呈绿色荧光；Texasred——荧光显微镜下发红色荧光②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。③生物素：Biotin④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）常用标记物31应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。应用32免疫组织化学染色的基本过程固定：由于在进行免疫组织化学反应时，蛋白质或肽类在体内易分解，并从活体存在的部位流失，而必须尽可能在接近活体的状态下，在尽可能短的时间内用固定剂将之交联起来，在原位固定那些物质。常用的固定液包括甲醛、多聚甲醛、戊二醛等。制片：切片（冰冻切片－对抗原保存性好，石蜡切片，树脂切片，震动切片）、铺片（视网膜）、细胞爬片反应免疫组织化学染色的基本过程固定：由于在进行免疫组织化学反应时33固定方法：推注，滴注滴注步骤：1、开胸2、暴露心脏3、自心尖剪开左心室4、插入灌流针至主动脉弓5、固定灌流针6、快速注入冲洗液（有时可免）7、先快后慢注入固定液8、慢注毕，将动物装入含有少量固定液的塑料袋置4ºC冰箱内静置2h后取材固定方法：推注，滴注34神经生物学的常用研究方法课件35染色方法ABC法PAP法染色方法ABC法PAP法36荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学371、免疫荧光细胞化学染色方法（1）直接法荧光素直接标记在特异性第一抗体上，荧光素标记的抗体直接与组织切片上相应的抗原结合，一次孵育成功，在荧光显微镜下观察→检测抗原。优点：简单，时间短，特异性强。

缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。

应用：基本不用了1、免疫荧光细胞化学染色方法优点：简单，时间短，特异性强。

38（2）间接法先用第一抗体孵育组织切片，在第一抗体与组织中的抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体孵育，第二抗体是抗产生第一抗体的动物（如兔、羊、小鼠等）的IgG的抗体。通过上述步骤用荧光素标记的第二抗体与第一抗体结合的方法来间接显示抗原所在的部位。

优点：较直接法灵敏，而且只需标记一种抗IgG抗体即可鉴定多种抗原。

（2）间接法优点：较直接法灵敏，而且只需39免疫荧光双标记法（1）直接法甲荧光标记的抗甲抗原抗体乙荧光标记的抗乙抗原抗体甲抗原乙抗原免疫荧光双标记法（1）直接法甲荧光标记的乙荧光标记的甲抗原乙40（2）间接法甲抗原乙抗原抗甲抗原抗体抗乙抗原抗体乙荧光标记的第二抗体（二抗）甲荧光标记的第二抗体（二抗）（2）间接法甲抗原乙抗原抗甲抗原抗体抗乙抗原抗体乙荧光标记的41两种第一抗体需来自不同种属的动物。将两种第一抗体混合后与组织孵育，然后用不同荧光素（如FITC和TexasRed）标记的二抗混合孵育，各自与其一抗结合。两种荧光素在荧光显微镜下发出不同荧光，可以更换滤色片系统分别进行观察。神经生物学的常用研究方法课件42免疫荧光双标记法的应用：1.将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来显示含有不同成分的两种细胞在同一区域的定位模式激光扫描共聚焦显微镜观察免疫荧光双标记法的应用：激光扫描共聚焦显微镜观察43免疫荧光双标记法的应用：2.将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来定位同一细胞内存在的两种不同成分免疫荧光双标记法的应用：442、免疫酶组织化学染色方法

用酶标记抗体和用组织化学方法显示结果，间接的对抗原物质进行定位。酶类标记物满足的条件：酶催化底物必须是特异的，并容易被显示（产物易于镜下观察）；酶反应形成的终产物必须是稳定的沉淀，不能从酶活性部位向周围组织弥散；容易获取（纯）；中性pH值时，具有稳定性；酶标记至抗体上不影响酶和抗体的活性。

2、免疫酶组织化学染色方法45常用酶类标记物辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP），H2O2和DAB（diaminobenzidine,二氨基联苯胺）为其常用底物，产物为稳定的棕黄色沉淀常用酶类标记物辣根过氧化物酶（horseradishper46碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP）：BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐)和NBT（Nitro-Blue-Tetrazolium，四氮唑蓝）是AP的常用底物组合，其中，NBT作为氧化剂,BCIP作为AP底物。BCIPBCIP被AP水解成一种蓝色的中间物，后者然后被NBT氧化形成二聚体（不溶性紫蓝色沉淀）。碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP47（1）PAP法

过氧化物酶—抗过氧化物酶（Peroxidaseanti-peroxidasemethod,PAP）法

PAP作为特异性显色基团。每个PAP复合物含２个抗HRP的IgG分子及３个HRP分子。DAB作为供氢体，HRP在H2O2存在的情况下，能使DAB发生氧化，生成不溶性棕褐色反应产物沉淀，定位在抗原所在处。首先，特异性第一抗体（多为兔、羊或小鼠IgG）孵育组织切片。其次用抗第一抗体的抗体（如羊抗兔IgG或驴抗小鼠IgG）作桥接。然后用PAP复合物与桥抗体结合。最后，用HRP的底物来显示PAP复合物。（1）PAP法

过氧化物酶—抗过氧化物酶48优点：灵敏度高，所用第一抗体的浓度可低于间接荧光法１０倍左右，并可长期保存。注意：桥抗体IgG分子有两个Fab段，一个与第一抗体结合，另一个与PAP复合物结合。桥抗体的两个Fab段是相同的，因此第一抗体及PAP复合物中的抗HRP抗体必须来自同一种动物。优点：灵敏度高，所用第一抗体的浓度可低于间接荧光法１０倍左右49（2）ABC法

卵白素-生物素-HRP复合物染色法（Avidin－biotinylatedhoreseradish

peroxidasecomplexmethod，ABC法）

Avidin：卵白素，一种糖蛋白，每个分子上有4个与生物素亲和力极高的结合位点，可以结合4个生物素。Biotin：生物素，为一小分子维生素，易于很多生物分子交联。ABC是卵白素-生物素结合的HRP复合物的简称，每一个卵白素分子上结合３个带HRP的生物素，留出一个能与其他生物素结合的空位。ABC复合物HRP卵白素生物素（2）ABC法

卵白素-生物素-HRP复合物染色法（Av50

ABC法是在第一抗体反应后，用生物素结合的IgG抗体（biotinylatedIgG）桥接。然后用ABC孵育，使桥抗上的生物素与ABC中卵白素上的空位结合。最后仍用HRP的底物呈色。＋B-IgGABCHRP卵白素生物素优点：由于生物素与卵白素间的亲和力极强，故ABC法比PAP法灵敏度更高。操作时间短，可长期保存。注意：ABC复合物与桥抗体之间是通过生物素结合的，因此ABC复合物没有种属特异性，可适合于任何种类的第一抗体。当然生物素结合的第二抗体必须是针对第一抗体属性的。ABC法是在第一抗体反应后，用生物素结合的IgG抗体（51荧光显微镜在照明系统的光源中使用高压汞灯提供全波段激发光为延长汞灯寿命，打开后不可立即关闭（至少15min），以免水银蒸发不完全而损坏电极；汞灯关闭后则不可马上打开（至少30min），否则灯内汞蒸汽尚未恢复液态，内阻极小，再次施加电压会引起短路，导致汞灯爆炸。荧光显微镜在照明系统的光源中使用高压汞灯提供全波段激发光为延52激光共聚焦显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。分辨率，是普通光学显微镜的3倍。用于观察细胞形态、细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。激光共聚焦显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成53/hbchendl/article/i5275.htm/hbchendl/a54免疫组织化学染色的对照实验阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，免疫组织化学染色结果应为阳性，称阳性对照。——证明靶抗原有活性，抗体的特异性高，染色过程中各个步骤以及所使用的试剂都合乎标准，染色方法可靠。阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。可排除染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的假阳性结果。

常用空白试验：即用稀释一抗的稀释液，如10%NSS等，或PBS替代一抗，反应应呈阴性；检查显示系统本身能否使组织染色。替代试验：正常兔血清或正常羊血清代替兔抗血清或羊抗兔IgG，反应应呈阴性；吸附实验：先将抗体与过量的与其针对的抗原（通常用10-6M）混合孵育，两者形成特异性结合，再用结合后的混合物孵育切片，染色结果应为阴性。若染色结果仍为阳性，则为非特异性染色。此法可证明待检组织切片的阳性结果是该抗体与组织内靶抗原特异性反应的结果。免疫组织化学染色的对照实验阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的55免疫组织化学法中的交叉反应抗体仅识别特异的抗原决定簇而不识别抗原本身，具有相同抗原决定簇的不同物质可以和同一种抗体结合。解决的最可靠的方法是将抗体用可能与之有交叉反应的抗原吸收，去除有交叉反应的抗体后，再用作免疫染色，或用已证明没有交叉反应的单克隆抗体。制成针对抗原不同片段的抗体，如各抗体均得出相同的染色结果，则存在交叉反应的可能性要小得多。但是，无绝对对照实验，其结果也是相对的。免疫组织化学法中的交叉反应抗体仅识别特异的抗原决定簇而不识别56原位杂交组织化学法原位杂交组织化学（Insituhybridizationhistochemistry，ISHH）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。原位杂交组织化学法原位杂交组织化学（57原位杂交组织化学法创于1969年。在神经形态学研究中，ISHH法主要用于显示细胞内的mRNA。此法目前很成熟，其灵敏度已达到可以显示细胞内仅几个拷贝的mRNA的程度。ISHH法是用标记的单链核酸探针与组织切片反应的方法。原位杂交组织化学法创于1969年。在神经形态学研究中，ISH58探针的类型1）按标记物①放射性探针（32P、35S及氚）②非放射性探针（生物素、碱性磷酸酶等物质标记的探针）2）按核酸性质①cDNA探针②RNA探针

③寡核苷酸探针分别于组织内相互补的mRNA结合，形成DNA-RNA或RNA-RNA杂交体。探针的类型59cDNA是指与mRNA互补的DNA链，由克隆技术产生，原位杂交的特异性强，比RNA探针简便，应用较广。主要缺点是cDNA探针通常是双链的，必须在使用前加温，使之分离成两条单链，其中之一条为cDNA链，能参与杂交。但无关DNA链可以和cDNA链重新结合（退火），在杂交过程中与mRNA争夺cDNA，而且其与cDNA链的结合可能比与mRNA的结合更容易。cDNA是指与mRNA互补的DNA链，由克隆技术产生，原位杂60RNA探针也是由克隆技术产生，技术上比cDNA困难。其优点是所产生的探针是单链的，不存在退火问题，因此灵敏度更高，RNA-RNA结合还比DNA-RNA结合稳定。寡核苷探针是人工合成的一段与mRNA互补的短核苷链。短探针有利于透入组织，寡核苷探针的制备容易，针对性强，因而特异性强。但由于探针短，其与mRNA结合不够牢固，故杂交及杂交后清洗的条件不能太苛刻。RNA探针也是由克隆技术产生，技术上比cDNA困难。其优点是61原位杂交组织化学技术的基本方法

由于核酸探针的种类和标记物的不同，故具体应用技术方法上有差异，但基本方法和应用原则大致相同。大致可分为：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示（visualization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。原位杂交组织化学技术的基本方法

由于核酸探针的种类和标62固定原位杂交组织化学技术（InSituHybridizationHistochemistry,ISHH）在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。在固定剂中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。固定63玻片和组织切片的处理玻片的处理玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。由于ISHH的实验周期长，实验程序繁杂，因此，要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果。玻片和组织切片的处理64增强组织的通透性和核酸探针的穿透性增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂（detergent）或称清洗剂TritonX-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。这种广泛的去蛋白作用可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。蛋白酶K（ProteinaseK）的消化作用在ISHH中是应用于蛋白消化的关键步骤，其浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用酶k1μg/ml(于0.1mol/lTris/50mmol/LEDTA,pH8.0缓冲液中),37℃孵育15～20min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。在蛋白酶K消化后，应用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。

神经生物学的常用研究方法课件65减低背景染色杂交后（Posthybridization）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextransulphate）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。

防止RNA酶的污染在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必须在150℃左右。

减低背景染色66杂交（Hybridisation）是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。加盖片的目的是防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发。杂交液的成分和预杂交液基本相同，所不同的是加入了标记的核酸探针和硫酸葡聚糖。探针的浓度和长度，杂交的温度和时间。探针的长度，一般应用于ISHH探针的最佳长度应在50～100个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。杂交反应温度方面，甲酰胺起了极为重要的作用，从而有助于保持组织的形态结构。

硫酸葡聚糖的主要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。杂交（Hybridisation）67杂交后处理（posthybridisationtreatment）杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。

在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。

显示（Visualization）

a放射性自显影b非放射性标记显示：碱性磷酸酶标记探针杂交结果用硝基四氮唑蓝等底物显示。杂交后处理（posthybridisationtreat68对照实验——同时设置证明特异性由于mRNA分子仅由4种核苷组成，因此存在着不同mRNA分子有某些相同核苷片段的可能性。因此原位杂交也存在与免疫组织化学相类似的交叉反应问题。探针越短，交叉反应的可能性越大。首先，在决定探针的碱基序列时，可用NorthernBlot法检查该探针能否识别正确的mRNA位置。对照实验——同时设置证明特异性由于mR69在组织切片上的对照可采用：①用核糖核酸酶进行杂交前处理，mRNA应不再出现；②用有意义探针在相邻切片进行杂交，应为阳性结果。③用过量的未标记探针作竞争试验，标记探针的特异结合将大为减弱。④在相邻切片对同一mRNA使用数种针对不同片段的探针进行杂交，能否得到同样结果。神经生物学的常用研究方法课件70原位杂交法和免疫组织化学法都是显示细胞化学成分的方法，两者相辅相成。两者的一个共同问题是反应的特异性问题。两种方法的互相印证可以彼此作为其特异性的证据。原位杂交法能更确切地反映某种物质表达的调节。mRNA量的消长通常反映了其表达的下调和上调，而免疫组织化学虽然也能反映细胞内物质的量的变化，但这种变化可以是由于其在细胞内合成量的变化，也可以是其从胞体释放或被代谢、分解量的变化。原位杂交法和免疫组织化学法都是显示细胞化学成分的方法，两者相71受体定位法神经活性物质担负着在神经元间传递信息的作用，在其所作用的神经元上（内）存在着特异性地与某一具有特定构造的神经活性物质特异性结合，而使其发挥调节效应的物质，称为受体。受体不仅分布在细胞体的胞膜上，也存在于树突、轴突等的膜上，还存在于胞核和胞浆内（儿茶酚胺类和肽类等亲水性物质的受体存在于胞膜上，类固醇激素等疏水性物质的受体存在于胞核或胞浆内）。免疫组织化学法：用针对受体的特异性抗体原位杂交法：已知受体的氨基酸序列，人工合成针对它们的特异性分子探针。配体法：主要在组织切片上进行，利用标记的配体和受体结合以示踪其部位。配体是与受体有亲和力的物质的总称。此法目前很少用。

受体定位法神经活性物质担负着在神经元间传递信息的作用，在其所72（二）生理药理学方法1、神经递质释放量的测定2、神经递质功能的测定

3、行为学方法（二）生理药理学方法1、神经递质释放量的测定731、神经递质释放量的测定（1）推挽灌流（2）脑内微透析术（3）伏安法（4）微穿刺术（5）脑片1、神经递质释放量的测定（1）推挽灌流74

在中枢神经系统中，复杂的神经联系要通过突触来传递。当动作电位到达突触前末梢时，突触前膜去极化，Ca2+内流，引起突触前膜内神经递质的释放，神经递质进入突触间隙后，通过扩散到达突触后膜，与位于突触后膜上的受体结合，引起突触后神经细胞的功能状态发生变化。从生理功能上来看，神经递质的释放是整个神经递质代谢各环节中的最重要的一环，它代表了中枢神经系统功能的主要方面。在中枢神经系统中，复杂的神经联系要通过突触75神经递质释放的动态变化可用在体和离体方法进行研究。推挽灌流是在体研究中枢核团递质释放的有用方法，通过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，从流出液中分析神经递质的变化。脑内微透析术是在推挽灌流基础上发展起来的新技术，其特点是灌流液在半透膜管内流动，不与脑组织直接接触，可测定脑组织细胞外液中不同生理状态下基础的、对药物反应的神经递质及其代谢产物释放量及其变化。伏安法是应用微电极测定脑内的生物胺及其代谢产物的方法，其时间分辨率比脑内微透析术高。微穿刺术能快速、简便获取脑核团组织进行化学测定。同位素标记脑片是离体研究神经递质释放过程及其机制的重要手段。神经递质释放的动态变化可用在体和离体方法进行研究。76在体研究特定脑区或核团递质释放的方法，通过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，从流出液中分析神经递质的变化。实验装置由三部分组成：灌流液泵和进液系统、灌流探头、灌流液收集系统。灌流液泵和进液系统由一个恒速泵和进液管组成。灌流液在恒速泵的推动下通过进液管进入到灌流探头内。灌流液通常为人工脑脊液。为减轻对脑组织的刺激，灌流时灌流液通常维持在36-37℃。灌流探头有多种形式，并列式推挽灌流探头结构较简单，但对脑组织损伤较大。同心圆式推挽灌流探头对脑组织损伤较小，是目前国内外常用的灌流探头。（1）推挽灌流在体研究特定脑区或核团递质释放的方法，通过推挽灌流套管，使灌77同心圆式推挽灌流装置由直径不同的同心圆不锈钢内、外套管和灌流泵组成。灌流时，灌流液经内套管进入局部脑组织，再由外套管经侧管吸出流入收集器。为了防止套管末端处的负压对脑组织的局部抽吸作用，减少脑组织的损伤，在外套管与侧管交接处开一小孔，在抽吸灌流液时让空气从小孔进入侧管，避免套管末端形成负压。同心圆式推挽灌流装置由直径不同的同心圆不锈钢内、外套管和灌流78收集的样品可通过高效液相层析、放射免疫测定等方法进行测定。两个问题：1推挽灌流时，灌流液直接与脑组织接触，可能造成灌流部位脑组织的损伤；2脑组织所释放的各种化学物质，包括各种蛋白质、多肽、氨基酸和小分子化学物质均可进入灌流液中，为测定灌流液中的特定神经化学物质带来干扰。因此，发展起来一种新的脑组织灌流技术，即脑组织微透析方法。收集的样品可通过高效液相层析、放射免疫79（2）脑内微透析术脑内微透析术是在特定的脑区内，植入由透析膜组成的透析管。当用灌流液持续灌流透析管时，待测的物质可顺浓度梯度进行扩散，或从脑组织的细胞外液进入透析管，或从透析管扩散至细胞外液，通过收集灌流液，测定其中的待测物质的含量，就可监测该物质的含量变化。脑内微透析时可以选用通透性不同的透析膜，以选择性地允许分子量在某一范围内（小于透析膜孔径）的化学物质通过透析膜进入灌流液中。所以，脑内微透析所能监测的神经化学物质主要是一些分子较小的神经递质和较小的神经肽，如去甲肾上腺素、多巴胺、脑啡肽等。（2）脑内微透析术脑内微透析术是在特定的脑区内，植入由透析膜80脑内微透析术的装置包括探头、导管、微量灌流泵、样品收集器和定量分析仪等。探头由流入管、流出管和中空纤维管构成。中空纤维管是能通过最大分子量为5000-50000的物质的透析管。探头按植入的方式可分为跨脑探头、U型探头和Ⅰ型探头。所有探头的植入均根据脑立体定位图谱，借助脑立体仪进行。脑内微透析术的装置包括探头、导管、微量灌流泵、样品收集器和定81常用透析液是人工脑脊液，透析的速度一般为0.1-10µl/min。样品的采集一般在透析开始后30-60min开始，这时透析液中的神经化学物质的回收率趋于稳定。注意灌流液中钙离子浓度要合适，过高或过低都会影响神经递质的释放和更新。分析结果时注意，所得结果仅仅是神经末梢释放到突触间隙的神经递质浓度的平均变化，这是以分钟或小时为单位时间的变化，而不能检测突触间隙神经递质浓度的瞬时变化。常用透析液是人工脑脊液，透析的速度一般为0.1-10µl/m82应用测定体内不同脑区各种内源性化学物质的浓度；刺激不同核团或神经通路对不同脑区神经递质的释放量的影响；动物自然行为的变化以及外界各种刺激引起的反应与内源性神经递质释放的关系；研究脑内各化学系统的功能性的相互作用；研究药物对脑内化学物质的影响；通过测定体内回收率的变化，可研究神经递质的释放和摄取及它们的调节；研究影响脑化学的病理变化如脑缺血时脑组织内的兴奋性氨基酸含量的变化等。应用测定体内不同脑区各种内源性化学物质的浓度；83（3）伏安法活体内包括脑内的细胞外液中存在一些具有氧化还原电活性的物质，如生物胺神经递质（去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺）及它们的代谢产物、抗坏血酸、尿酸、谷胱甘肽等。若在细胞外液中加入2个电极，接通电源，在电极处就会出现电解反应（在阴极出现氧化反应）。应用微电极进行电解，并记录电流-电压曲线（又称伏安图），这个过程称为伏安法。（3）伏安法活体内包括脑内的细胞外液84基本原理基本原理85递质释放的动态过程递质释放的动态过程86测量仪器与设备碳纤维电极：聚丙稀微碳纤电极（细胞，脑片）柱状碳纤电极（在体）膜片钳放大器（电压钳模式）数据采集接口卡计算机系统测量仪器与设备碳纤维电极：87优点胞吐活动的检测不受胞吞活动重叠的干扰直接检测释放的物质量化测量单个囊泡的分泌实时监测无创伤测量优点胞吐活动的检测不受胞吞活动重叠的干扰88局限性可检测的物质：氧化电压小于1000mV的递质分子（肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、组胺、抗坏血酸等）。

谷氨酸、乙酰胆碱、GABA、胰岛素等不能被检测。碳纤电极测量的只是直接与碳纤电极尖端相接触或距离小于5µm范围内的那些小泡分泌。只能测量胞吐但不能测量胞吞。

局限性可检测的物质：氧化电压小于1000mV的递质分子（肾上89恒电位（安培法，amperometry）时间分辨率高三角波循环电压（伏特法，voltammetry）能鉴别是哪种递质分子但测量灵敏度比安培法低因此，如果已知该细胞分泌的是哪一种递质，一般都使用安培法来记录细胞分泌。恒电位（安培法，amperometry）90碳纤电极性能测试1.电学特性测试

电极尖端缓慢浸入生理溶液中,HP=780mV。由于电极极化作用,碳纤电极的检测电流(Iamp)波形会有一上冲。好的电极由于其漏电流很小,在十几秒到几十秒后电流波形会降至10pA以内。碳纤电极性能测试1.电学特性测试912.电极氧化性能测试2.电极氧化性能测试923.肾上腺嗜铬细胞分泌的检测和判定3.肾上腺嗜铬细胞分泌的检测和判定93

伏安法的优点是时间分辨率高，伏安法电极的反应时间短，可用于检测脑内单胺递质快速的动态变化。伏安法的碳素纤维微电极（一般在10-20µm）远比脑内微透析中的微透析管（大于200µm）口径小，可减少脑组织的损伤及可检测脑内小核团的神经活性物质。但微透析法中用HPLC检测样品，有很高的特异性，而且一次可同时检测多种神经活性物质，可同时了解不同物质的动态变化及它们之间的相互作用，这是伏安法难以做到的。

94假递质标记法：原理是对于特定的分泌细胞，寻找一种该细胞的分泌小泡内本来不存在，但分泌小泡能够自动摄取的“易氧化分子”。将该易氧化物质放到细胞外液中，待分泌小泡摄取足够易氧化分子后便可做CFE实验。电极涂层法：原理是对于待测量的特定递质，寻找一种能够选择性“催化”该递质的化学物质或生物酶，并将该物质“镀”到CFE电极尖端，当递质分子到达CFE电极尖表面时，首先经“镀层”物质催化而在小于1000mV条件下氧化，氧化电流成为涂层CFE的信号。寻找高效率并且稳定性较高的涂层是本方法的关键。

假递质标记法：原理是对于特定的分泌细胞，寻找一种该细胞的分泌95（4）微穿刺术微穿刺术是利用中空针管切取脑片中的特定核团，用于检测其化学成分，包括神经递质及其代谢产物等。动物处死后立即取出脑，迅速将所需的脑区作冷冻切片。在显微解剖镜下，确定脑片中要切取的脑核团的位置，然后用中空针管穿刺脑片切取样品。然后，将样品进行适当的处理，如匀浆、超声波破碎或提取等，最后进行化学测定。能快速、简便获取脑核团组织进行化学测定。微穿刺术广泛应用于神经科学的研究。用于了解神经递质、神经肽、酶和受体等在脑区中的分布，测定这些化学物质在实验条件和病理条件下的改变。优点：操作简单快捷且非常可靠，有很高的解剖结构的分辨率，样品经过适当处理后可用许多分析技术进行测定。缺点：组织样品是在死后获得的；样品中的神经元失去了传入和传出的联系；在处理过程中如匀浆等会引起缺氧。（4）微穿刺术微穿刺术是利用中空针管切取脑片中的特定核团，用96（5）脑片离体研究神经递质释放过程及其机制的重要手段。过程包括：脑片制备：麻醉后取脑，将选择好的脑区切成脑片。孵育：5﹪CO2、95﹪O2饱和的缓冲液，37℃。标记脑片：孵育液中加入适量的含放射性同位素的神经递质或其前体标记脑片。脑片的神经末梢对这些物质应具有高亲和力摄取，使神经末梢的递质贮库被放射性物质选择地标记。（5）脑片离体研究神经递质释放过程及其机制的重要手段。97灌流装置释放量的测定：基础释放量去极化刺激引起的释放量：①电场刺激②高钾浓度去极化最后检测流出液和组织的放射活性，或用HPLC检测。灌流装置982、神经递质功能的测定

突触前神经末梢的递质是以量子式释放的，其量很微小，因此在进行神经递质功能测定时，只能用最小而有效的剂量模拟神经递质的生理效应。（1）微电泳：能将微量的神经递质导入神经元附近，观察其作用。（2）抗体微量注射2、神经递质功能的测定突触前神经末梢99•定义：借助微电极通以一定的电流将解离物质电泳到神经元附近，观察神经递质或其他药物对该神经元的作用。•基本原理：外加电流通过含解离物质溶液的微电极时，会将微电极内的解离物质从管尖释放出来。例如在微电极接正极，动物头皮接负极时，带阳离子的物质从微电极中释出。相反，微电极接负极，头皮接正极（内向电流）时，微电极释出的是带负离子的物质。微电泳时解离物质从微电极释出量，与它通过的电荷量成正比。因此，通常用微电极的电流强度表示解离物质的释放量。•方法：1）拉制微电极：五管：每管尖端直径1-3

m,五管总直径5~10

m..其中，一管为纪录，一管为对照，三管为药物。若需作细胞内记录，则有一管应较其他管略长，以便插入细胞内。

（1）微电泳Microelectrophoresis•定义：借助微电极通以一定的电流将解离物质电泳到神经元附近100药物管可根据实验需要，将神经递质或药物配成离子化溶液。为此常用稀释的NaOH溶液或HCl溶液制备，并调整溶液的pH值，使要作微电泳的物质呈阳离子或阴离子，以便微电泳时能将所需要的解离物质导入所要观察的神经元。2）微电极充满溶液后，在立体定位仪帮助下，将微电极插至所需要观察的脑核团内的神经元附近。微电泳仪上的输出接头通过Ag-AgCl细丝插入微电极各管中，另一共用接头连在动物头皮上，是每一管电极与头皮电极之间形成回路。然后，立即施加滞留电流防止自发性外溢。微电泳时选择一定强度（nA）的电流通过微电极，微电极中的解离物质释放量与通电电流强度成正比。药物管可根据实验需要，将神经递质或药物配成离子化溶101多管微电泳方法具有三大特点。第一，与离体实验相比，应用这种方法得到的实验结果能够提供整体条件下目标细胞功能状态的信息。第二，药物的作用范围很小，可以精确定位到一个或几个细胞的反应，所以用来研究药物对单个神经细胞的直接作用。第三，可以通过改变微电泳电流的大小来调节所施加药物的量。多管微电泳方法具有三大特点。102Microionphoresis:Thismethodsenablesaresearchertoapplyverysmallamountsofdrugsorneurotransmittercandinatestothesurfaceofneurons.Microionphoresis:103应用：将神经递质或药物越过血脑屏障直接作用于神经元，甚至突触前膜和后膜，观察这些递质和药物对它们的作用。可以直接对所记录的神经细胞施加多种受体的激动剂或拮抗剂，确定该神经细胞膜上是否存在这种受体，激活或阻断这种受体引起神经细胞发生兴奋还是抑制。另外，还可将跨膜信号传导通路中某些关键因子如G-蛋白、第二信使等的激动剂或抑制剂通过微电泳方法施加到记录的神经细胞处，从而研究受体激活后的信号传导通路。应用：将神经递质或药物越过血脑屏障直接作用于神经元，甚至突触104•基本原理:抗体抗原中和反应。特异性抗体注射在某一脑区，可中和神经末梢释出而进入突触间隙的神经肽，防止其与受体结合。因此，用此方法可解释消除该神经肽的生理效应的结果，从而推测内源性神经递质的作用。•中枢内直接注射法包括：脑室内注射，通过脑内埋植慢性套管和脊髓蛛网膜下腔慢性插管进行恒速微量注射等方法，或通过玻璃微电极向被纪录的神经元附近微量注射。（2）抗体微量注射•基本原理:抗体抗原中和反应。特异性抗体注射在某一脑区，1053、行为学方法经典条件反射操作式条件反射动物必须完成某种运动或操作后才能得到强化。例如，将大鼠放入实验箱内，当它在走动中偶然踩杠杆时即喂食，以强化这一操作，如此重复多次，大鼠即学会自动踩杠杆而得食。踩杠杆这样一个特定的动作就是条件反应，简称反应。操作式条件反射代表了反应与强化之间的关系。

3、行为学方法经典条件反射106神经生物学的常用研究方法课件107（三）生物化学方法神经科学中，生物化学方法的主要任务是分离和分析神经组织以及与神经活动有关的种类繁多的化学组分，特别是诸多的神经递质、调质、激素、生长因子及其受体，这些物质的含量极微，有些组分很容易失去活性。因此，和其他领域比较，更需要用温和的、高回收、高分辨和高灵敏度的分离分析方法。（三）生物化学方法神经科学中，生物化学方1081、层析分离技术2、放射免疫测定法3、酶联免疫吸附法4、免疫印迹法1、层析分离技术109层析，也称为色谱分析，是一种分离技术，其基本原理是利用不同的物质在两个相（即固定相和移动相）之间具有不同的分配系数，即不同物质和固定相缔合的紧密程度以及用液体（即移动相）淋洗时被洗脱的难易程度的不同，而达到将样品中所含的各种物质分离的目的。其优点是分离条件温和，有利于保持生物活性，并适合于大量制备。1、层析分离技术层析，也称为色谱分析，是一种分离技术，110

层析法进行时有两个相，一个相称为固定相(Stationaryphase)，通常为表面积很大的或多孔性固体；另一相称为流动相(Mobilephase)，是液体或气体。当流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离，或者说，易分配于固定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，因而得到逐步分离。层析法进行时有两个相，一个相称为固定111层析分离法基本原理层析分离法基本原理112层析技术的分类

按两相所处的状态分类以液体作为流动相的层析称为液相层析，以气体作为流动相的称为气相层析。其固定相也可有两种状态，一种是以固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂布在固体载体表面的液体作为固定相。层析技术的分类按两相所处的状态分类113层析气相层析（gas-chromatography）液相层析（liquid-chromatography）气-固层析（gas-solidchromatography）气-液层析（gas-liquidchromatography）液-固层析（liquid-solidchromatography）液-液层析（liquid-liquidchromatography）层析气相层析（gas-chromatography）液相层析1142.按操作技术形式分类

.柱层析（columchromatography）

将固定相装在层析柱中，使样品朝着一个方向移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。

纸层析（paperchrmatography）

用纸作为液体的载体，样品点在纸上随后展开达到分离鉴定的方法。

薄层层析（thinlayperchromatography）

将适当的吸附剂在玻璃板或其他材料薄板上铺成薄层，样点在上面随后用流动相展开达到分离鉴定的方法。2.按操作技术形式分类1153.按层析过程的机制可分为①吸附层析(adsorptionchromatography)

利用吸附剂对不同组分吸附能力的不同加以分离的方法。②离子交换层析（ion-exchangechromatography）

利用离子交换剂与各组分之间的离子亲和力不同而进行层析分离的方法。③凝胶层析（gelchromatography）

利用不同组分之间分子大小不同，在通过凝胶介质时所受到的阻滞作用的差异而进行分离的方法。④亲和层析（affinitychromatography）利用生物大分子之间特有亲和力的不同进分离纯化的方法。3.按层析过程的机制可分为116①吸附柱层析

是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的一种层析方法。常用的吸附剂有：极性的和非极性的两种极性的有：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等;非极性的有：活性炭等。①吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂117基本原理

在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点；吸附位点通过范德瓦尔力(中性分子彼此距离非常近时，产生的一种微弱电磁引力)和静电引力与蛋白质和核酸等生物分子结合；其结合力的大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。

基本原理在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。118例如把含结构不同的A、B二种物质的混合溶液加至装有吸附剂的层析柱；而后，注入适宜的洗脱剂，控制速度让其下流；便可借助A、B两种物质对吸附剂结合力的差异性，将它们二者分离。假如吸附剂对A的结合力小于B时，则B留在柱子上部，A移至柱子的下部。

例如119A、B二物质在柱上得以分离，是由于A、B二物质在固定相(吸附剂)与流动相(洗脱剂)之间的分配系数(即物质在固定相中的浓度除以它在流动相中的浓度)不同所致。

如果A物质分配系数小于B物质时，则A在柱子上移动的速度大于B。

A、B二物质在柱上得以分离，是由于A、B二物质在120②离子交换层析

离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。离子交换层析具有灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。②离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂上的可121

离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要是以离子交换方式进行。所进行的离子交换反应是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+可发生可逆的交换反应，反应式为：RA+B+

→RB+A+该反应能以极快的速率达到平衡，平衡的移动遵循质量作用定律。离子交换反应离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要是以离子交122

两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力，主要决定于它们的理化性质和特定的条件下呈现的离子状态。当pH<pI时，能被阳离子交换剂吸附，反之，当pH>pI时，能被阴离子交换剂吸附。若在相同pI条件下，且pI>pH时，pI越高，碱性越强，就越容易被阳离子交换剂吸附。离子交换层析就是利用离子交换剂的荷电基团，吸附溶液中相反电荷的离子或离子化合物，被吸附的物质随后为带同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。由于各种离子或离子化合物对交换剂的结合力不同，因而洗脱的速率有快有慢，形成了层析层。这种方法对分离神经肽很有效，因为只要改变溶液的PH，使其不等于多肽的等电点，就可使其带电荷。两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力，主123示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）1241.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：梯度缓冲溶液先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离125凝胶层析是以各种多孔性凝胶填料为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种技术。

突出优点是：凝胶不带电荷、吸附力弱、不需再生处理可反复使用、操作条件温和、对分离成分不变性和破坏、对高分子物质有很好的分离效果。

③凝胶层析凝胶层析是以各种多孔性凝胶填料为固定相，利用流动126127基本原理凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。 127基本原理凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进127

1、比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；2、较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；3、分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间。

神经生物学的常用研究方法课件128也叫凝胶过滤层析也叫凝胶过滤层析129凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠130t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：>>t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：>131

分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。132④亲和层析生物亲和作用：生物物质具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性（能区分结构和性质非常相近的其它分子）。

亲和层析(AffinityChromatography，AC)是利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。④亲和层析生物亲和作用：生物物质具有识别特定物质并与该物133其固定相与被分离的物质呈高亲和性、特异性的结合，因此可使样品中所含的微量的被分离物质与固定相结合，而这种结合又是可逆的，因而能被洗脱下来。由于可逆性的特异结合在生命现象中比较普遍而且非常重要，如抗原-抗体、受体-配体、酶-底物之间的结合等，因此亲和层析是一种很重要而又常用的分离生物活性物质的方法。亲和层析可分为两大类：一类是将配体、底物共价结合于凝胶上，以此作为固定相用于分离受体和酶蛋白，总称为配体亲和层析；另一类是将抗体固定于凝胶，用于分离抗原，称为免疫亲和层析。其固定相与被分离的物质呈高亲和性、特异性134(1)酶—底物或抑制剂(2)抗原—抗体。(3)激素—受体。(4)糖蛋白与凝集素,(5)生物素—生物素结合蛋白等

神经生物学的常用研究方法课件135神经生物学的常用研究方法课件136高效液相层析高效液相层析（highperformanceliquidchromatography,HPLC）是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程，它借溶质在两相间分配系数、亲合力、吸附能力、离子交换或分子大小不同引起的排阻作用的差别使不同溶质进行分离。HPLC分析蛋白质不仅简便快捷，而且选择性好，分离效率高，检测灵敏度高（pmol甚至fmol水平）。

高效液相层析高效液相层析（highperformance137HPLC的原理和普通柱层析完全相同，所不同的是用高压加快了洗脱液在层析柱内的流速，使分离速度缩短到几十分钟甚至几分钟；解决了微粒型（直径5-10µm）填料的高压匀浆装柱技术，使层析柱的柱效达到每米几万甚至十万以上的理论塔数（理论塔数反映了移动相和固定相之间的分配次数，普通层析柱的理论塔数为每米数千），因而极大地提高了分离的效率，即分辨率。HPLC的仪器已配上高灵敏度的在线