实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测

试验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】把握纸片集中法〔K-B法、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。生疏上述两种药敏试验方法的应用。了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。【试剂与器材】1．培育基：一般需氧和兼性厌氧菌承受水解酪蛋白〔M-H〕琼脂或M-H液体培育基pH7.2~7.。对于养分要求高的细菌，则需在M-H培育基中参与其它养分成分。2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有确定量的某种抗菌药物。市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监视治理局〔SFDA〕批准。不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。待测细菌接种一般养分琼脂经35℃16~18h0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048molBaCl2

(1.17%W/VBaCl2

.2HO)0.5ml20.18molHSO(1%,V/V)99.5ml2 4将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期6其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培育箱等。【试验内容】〔K-B〕药敏试验原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板外表于琼脂中，并沿纸片四周由高浓度向低浓度集中，形成渐渐削减的梯度浓度。在纸片四周，确定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透亮的抑菌环对该种药物的敏感程度。K-B法是由KirbyBauer建立，美国NCCLS法〔定性法。方法培育基的预备：将无菌M-H琼脂加热溶化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。4mm〔23~25ml4℃保存，在537℃30min试验菌液预备：将待测细菌接种于一般琼脂平板，35℃培育16~18h，然后从平板2~3ml0.5108CFU/ml。细菌接种：用无菌棉拭蘸取已调试的菌液，在管壁上稍加挤压之后，手持棉拭于M-H360°3~5min贴纸片用无菌镊子夹取药物纸片平贴在种好细菌的琼脂外表，每个平板可贴4~6种药物纸片。纸片放置要均匀，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板边缘的距离应不15mm。纸片一旦接触琼脂外表，就不能再移动。培育：贴好药物纸片的平板应于室温下放置15min，然后翻转平板，放35℃培育18~24h结果观看和报告测得结果以毫米为单位进展记录，最终参照NCCLS的标准〔见附录〕进展结果推断，并以敏感sensitivit、中度敏感morderatesensitivit〕和耐药resistan〕等程度报告之。留意事项〔1〕培育基的成分、酸碱度以及平板的厚度等对试验结果都可以造成影响。购置培育M-H时，留意其厚度并且厚薄要均匀。药物纸片的贴放要均匀，并且要充分接触琼脂。药物纸片应始终保存在封闭、冷冻、枯燥的环境，否则会影响其活性。长期储存须置-20℃的冰箱，日常使用或没用完的纸4℃1~2h菌液浓度也可影响试验的结果，浓度大细菌多时抑菌环减小；菌量少时抑菌环则15min35℃2试验过程严格按要求操作，严格无菌操作。抑菌环的测量要认真、准确。ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在一样条件下用与常规试验一样的方法测定对同种抗菌告，应准时查出缘由，予以订正。标准菌株应每周用M-H，4℃保存。临床意义：用于临床细菌常规药敏检测，监测细菌的耐药变迁，指导临床用药。1．原理将待测细菌种于一系列含有不同浓度抗菌药物的液体培育基中或杀死该菌的最低抑菌浓度〔minimalinhibitoryconcentration,MIC〕或最低杀菌浓度minimalbactericidalconcentration,MB2．方法抗菌药物原液的配制：试验用的抗菌药物应为标准的粉剂，选择适宜的溶剂和稀释剂进展溶解和稀释〔表7-2，并配成确定浓度〔通常为1000U或100μg/m〕的药物原液。原液以过滤法除菌，小量分装使用，放-20℃以下一般可保存三个月，假设置4℃只能保存一周。待测菌液的预备：分纯的平板上挑取4~5个菌落，接种于3~5mlM-H35℃4~6h0.5M-H1∶20015min试验方法：排列试管：取无菌试管10~15支排列于试管架上，除第一管外，其余每管参与M-H1ml。药物稀释：吸取抗菌药物原液〔1000μg/ml〕5.12ml4.88ml无菌大试管中，充分混合后，从中吸出2ml分别参与第一、其次管中，每管1ml；其次管混匀1ml1ml，各管的药物浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03μg/ml；另设培育基比照、待测菌生长比照和质控菌生长比照管。细菌接种：将已预备好的菌液分别参与到上述各试验管和比照管中，每管0.05ml，轻轻旋转混匀。35℃12~18h结果推断及报告抑菌浓度MIC。并以MIC报告之。假设以0.01ml容量接种环从无菌生长的试管中移种一环于血琼脂平板上划线作次代培育，经35℃培育过夜后，观看能杀死99.9%的种入菌的最低药物浓度即为最低杀菌浓度MBC。留意事项培育基的pH、渗透压和电解质均可影响试验结果。抗菌药物必需使用标准粉剂，不应使用口服药而影响其含量。配好后的药物原液应在有效期使用。考虑到抗菌药物的效力，不同药物应选择不同的稀释度。试验过程易污染，应严格无菌操作。结果应在12~18h内观看，培育时间过长，被轻度抑制的局部细菌可能会重生长，由于某些抗菌药物不够稳定，时间长了其抗菌活性也会降低，甚至消逝，从而使MIC增高。质量把握：每次试验应选用金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在一样条件下作平行试验的缘由。临床意义：多用于抗菌药物抗菌效力的测定，药开发。目前临床的自动化或半自动化的药敏试验多承受与次类似的微量稀释法。三、局部细菌耐药表型的检测耐甲氧西林葡萄球菌的检测〔头孢西丁纸片集中法〕甲氧西林(methicillin)是一种能耐青霉素酶的半合成青霉素。耐甲氧西林金黄(methicillinresistantStaphylococcusaureus,MRSA)mecＡ基因编码的青霉素结合蛋白〔PBP2α〕而对甲氧西林耐药。这种PBP2α不但与β－内酰胺类抗生素的亲和力极低，而且具有其他高亲合力青霉素结合蛋白(PBPs)的功能。当其他PBPs被β－内酰胺类抗生素抑制而不能发挥作用时，PBP2α可替代它们完成细菌细胞壁的合成，从而使细菌得以生存。MRSA从1961年觉察至今几乎普及全球，已成为院内感染的重要病原菌之一。因此，开展对 MRSA的检测，对于把握医院内感染的流行，指导临床治疗有着格外重要的意义。原理：同纸片集中法。由于头孢西丁和苯唑西林较甲氧西林稳定，不易失活，通常使用这两种药物代替甲氧西林测定葡萄球菌的耐药性。方法：以无菌棉拭蘸取已调试的待测菌液接种于M-H琼脂平板上〔同K-B法再贴上头孢西丁药物纸片30μg/片〕或苯唑西林药物纸片μg/片，将平板置于24h，之后观看结果。结果推断：头孢西丁纸片法：金黄色葡萄球菌抑菌环≥20mm19mm葡萄球菌≥25mm24mm苯唑西林纸片法：金黄色葡萄球菌抑菌环≥13mm10mm性葡萄球菌≥18mm17mm留意事项：，抑菌环内有任何可区分的细菌生长即为苯唑西林耐药。培育温度应为33~35℃，超过35℃耐药的葡萄球菌可能被抑制不能生长而漏检。肠杆菌科细菌产超广谱β-内酰胺酶的检测超广谱β-内酰胺酶〔extended-spectrumβ-lactamase,ESBLs〕是指能水解青霉素类和头孢菌素类抗生素并扩展到能水解第三β1983ESBLs上升的趋势。并具有多重耐药和转移快速等特点，极易导致院内穿插感染和耐药菌的集中。产生ESBLsESBLs临床试验室标准化委员会〔NCCLS〕所推举的纸片集中法、稀释法，并分筛选试验和确认试验两步进展。〔1〕筛选试验〔纸片集中法〕药物纸片：头孢泊肟(Cefprozil,CPD)10μg/片 或头孢他啶(Ceftazidime,CAZ)30μg/片或氨曲南(Aztreonam,ATM)30μg/片 或头孢噻肟(Cefotaxime,CTX)30μg/片 或头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)30μg/片〕0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于M-H外表贴上头孢他啶等药物纸片〔同K-B法，之后放35℃温箱中培育16-18h观看结果。结果推断：头孢泊肟抑菌环直径≤17mm头孢他啶抑菌环直径≤22mm肠杆菌科细菌铜绿假单胞菌葡萄球菌属肠球菌属A肠杆菌科细菌铜绿假单胞菌葡萄球菌属肠球菌属A一级试验并常规报告的药物氨苄西林头孢他啶苯唑西林头孢唑啉头孢噻吩庆大霉素青霉素或氨苄西林青霉素庆大霉素美洛西林或替卡西林符合以上任何一项即可认为该菌能产ESBLs。质量把握：以大肠埃希菌ATCC25922做质控，其抑菌环直径应符合CLSI质控范围。以肺炎克雷伯菌ATCC700603头孢泊肟抑菌环直径9~16mm10~18mm氨曲南抑菌环直径9~17mm17~25mm16~24mm〔2〕表型确证试验〔双纸片增效法〕原理：克拉维酸可与多数β-内酰胺酶结实结合，生成不行逆的结合物，为一种格外有效的抑制剂。在同一平板上贴加克拉维酸纸片，可以抑制细菌β-内酰胺酶的作用，从而使头孢他啶等抗菌药物的抑菌环增大。药敏纸片：头孢他啶〔30μg/片〕克拉维酸〔ClavulanicAcid，CLA，10μg/片〕头孢噻肟〔30μg/片〕方法：将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上〔同K-B法琼脂培育基外表分别贴上头孢他啶和头孢他啶//克拉维酸纸35℃16~18h结果推断：与单纸片平皿比照，两种药物中的任何一种假设加克拉维酸纸片较未加克拉维酸纸片抑菌环直径≥5mm，即为ESBL质量把握以大肠埃希菌ATCC25922所测试药物联合克拉维酸后的抑菌环直径与单药抑菌环相比，增大值≤2mm肺炎克雷伯菌ATCC700603：头孢他啶/卡拉维酸抑菌环直径应增大≥5mm；头孢噻肟/克拉维酸抑菌环直径应增大≥3mm。【结果记录和报告】7-1非苛氧菌常规试验和报告中应考虑的抗微生物药物推举分组阿米卡星B组 阿莫西林/克拉维酸或

哌拉西林阿米卡星 阿奇霉素或克拉霉素或

达托霉素验有选择报告的药物

氨苄西林/舒巴坦哌拉西林/他唑巴坦替卡西/克拉克维酸头孢孟多或头孢尼西或头孢呋辛头孢吡肟头孢美唑头孢哌酮头孢替坦头孢西丁头孢噻肟或头孢唑肟或头孢曲松

氨曲南头孢哌酮头孢吡肟环丙沙星左氧氟沙星亚胺培南美洛培南

红霉素克林霉素达托霉素利奈唑胺泰利霉素甲氧苄啶/磺胺甲噁唑

利奈唑胺奎奴普汀/达福普汀厄他培南亚胺培南或美洛培南美洛西林或哌拉西林

替卡西林甲氧苄啶/磺胺甲噁唑替卡西林甲氧苄啶/磺胺甲噁唑氯霉素庆大霉素C氨曲南头孢他啶环丙沙星或链霉素验有选择左氧氟沙星报告的药氯霉素加替米星或物卡那霉素莫西沙星奈替米星奈替米星氯霉素四环素奎奴普汀/达红霉素福普汀四环素妥布霉素庆大霉素利福平利福平四环素羧苄西林羧苄西林美罗沙星或环丙沙星U西诺沙星或诺氟沙星罗美沙星或诺氟沙星左氧氟沙星或氧氟沙星诺氟沙星或诺氟沙星验有选择氧氟沙星呋喃妥因呋喃妥因报告的药

万古霉素 万古霉素物物加替沙星氯碳头孢磺胺异噁唑甲氧苄啶四环素呋喃妥因磺胺异噁唑甲氧苄啶/磺胺甲噁唑注：试验常规抗菌药物选择在标准中分成A、B、C、UAB①对A组同类抗生素耐药；②标原来源不同时，如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，AC组药物用于对AA〔如肠外分别的沙门菌属或耐万古霉素肠球菌。U表7-2 常见抗菌药物原液的溶剂及稀释剂抗生素溶剂稀释剂阿莫西林/克拉维酸磷酸盐缓冲液0.1mol/L,pH6.0磷酸盐缓冲液0.1mol/L,pH6.0替卡西林/克拉维酸磷酸盐缓冲液，0.1mol/L,pH6.0磷酸盐缓冲液0.1mol/L,pH6.0磷酸盐缓冲液，头孢匹罗磷酸盐缓冲液，0.1mol/L,pH6.00.1mol/L,pH6.0头孢噻吩及其它头孢菌素磷酸盐缓冲液0.1mol/L,pH6.0水氨苄西林磷酸盐缓冲液0.1mol/L,pH8.0磷酸盐缓冲液0.1mol/L,pH6.0亚胺培南磷酸盐缓冲液，0.01mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲液0.01mol/L