保元汤物质基准uplc-pda指纹图谱的建立及成分指认

保元汤物质基准uplc-pda指纹图谱的建立及成分指认

宝元汤是著名的古代经典方剂目录（第一批）。保元汤的现代研究目前仅涉及到药理研究和临床应用方面，化学成分研究很少，对其指纹图谱研究至今未见报道。基于此，本实验应用现代工艺进行保元汤物质基准的制备，通过色谱技术和质谱技术对各成分进行分离鉴定研究。利用UPLC-PDA技术建立了保元汤物质基准的指纹图谱，并通过UPLC-ESI-MS/MS进一步对共有峰进行研究，指认了22个共有峰，可为保元汤质量标准的制定及成药的开发奠定基础。1药材来源及热价ACQUITYUPLCH-Class型超高效液相色谱仪和VionIMSQTOF型离子淌度分析高分辨质谱仪（美国Waters公司），Quintix125D-1CN型1/1万电子分析天平（德国赛多利斯公司）。甘草酸铵，人参皂苷Rg保元汤处方药材均采自道地产区，采集批次均超过25批，经中国中医科学院中药研究所陈士林研究员鉴定，人参为五加科植物人参Panaxginseng的干燥根和根茎，黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceusvar.mongholicus的干燥根，甘草为豆科植物甘草Glycyrrhizauralensis的干燥根和根茎，肉桂为樟科植物肉桂Cinnamomumcassia的干燥树皮，生姜为姜科植物姜Zingiberofficinale的新鲜根茎，按照2015年版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）要求炮制加工，制成饮片，经鉴甄检测技术（上海）有限公司按2015年版《中国药典》要求全检，各挑选15批合格饮片，各药材产地与批号信息详见表1。将各批饮片随机组合，根据《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准申报资料要求（征求意见稿）》2方法和结果2.1条件1以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ACQUITYUPLCBEHShieldC2.2标准物质的制备分别取人参皂苷Rb2.3保元汤基准冻干粉的制备保元汤物质基准的制备方法参照《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准申报资料要求（征求意见稿）》，根据明代一钱=3.73g和一分=0.373g折算，确定处方为人参3.73g，黄芪7.46g，甘草1.86g，肉桂0.75g，生姜1片按3g折算。分别按表2中组合称取4倍处方量饮片，放入煎药壶中，浸泡30min，一煎加水800mL，煎煮60min，二煎加水760mL，煎煮40min，减压浓缩后进行冷冻干燥，即得保元汤物质基准冻干粉，批号分别记为BYT01～BYT15。分别取BYT01～BYT15冻干粉约0.2g，精密称定，置15mL量瓶中，加50%甲醇超声处理（功率250W，频率40kHz)30min，放冷，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得。2.4耐试验2.4.1酸水溶液洗脱系统分别考察了甲醇-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、甲酸乙腈混合液-甲酸水溶液等洗脱系统，结果表明甲酸乙腈混合液-甲酸水溶液系统的分离效果较好，进一步考察了甲酸乙腈混合液-甲酸水系统中甲酸的比例，最终确定以0.05%甲酸水溶液为流动相A,0.05%甲酸乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱的效果较好。2.4.2样品溶液的制备方法分别考察了3种不同型号C2.4.4柱温的确定分别在20,30,40℃不同柱温条件下考察柱温对分离条件的影响，结果表明不同柱温条件下色谱图整体变化较小，说明柱温影响不显著，拟采用柱温30℃。2.5方法研究2.5.1仪器精密度试验取批号BYT01的保元汤物质基准，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，结果显示各共有峰在2个波长条件下保留时间的RSD均≤1.0%，峰面积的RSD均≤2.0%，表明仪器精密度良好。2.5.2重复性试验取批号BYT01的保元汤物质基准6份，按照2.3项下方法制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，结果显示各共有峰在2个波长条件下保留时间的RSD均≤1.0%，峰面积的RSD均≤5.0%，说明该方法重复性良好。2.5.3溶液稳定性试验取同一批次保元汤物质基准，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0,2,8,10,16,24h按2.1项下色谱条件测定，结果显示各共有峰在2个波长条件下保留时间的RSD均≤1.0%，峰面积的RSD均≤3.0%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。2.6指纹谱的构建2.6.1指纹图谱的制备按2.3项下方法制备15批保元汤物质基准供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图，以峰面积占总峰面积0.1%进行积分，分别将203nm和260nm处得到的色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统”（2012版），采用中位数法进行指纹图谱分析，得15批保元汤物质基准的指纹图谱，见图1,2；同时，生成对照指纹图谱，见图3,4。2.6.2指纹图谱的相似度采用“中药指纹图谱相似度评价系统”（2012版）软件分别对保元汤物质基准在203nm和260nm处的UPLC图谱进行相似度分析，结果显示15批物质基准与对照指纹图谱的相似度均>0.90，样品BYD01～BYT15在203nm处的相似度分别为0.955,0.970,0.986,0.963,0.926,0.963,0.960,0.968,0.951,0.949,0.972,0.979,0.954,0.983,0.961；在260nm处的相似度分别为0.979,0.996,0.963,0.969,0.974,0.967,0.978,0.994,0.962,0.964,0.989,0.988,0.977,0.975,0.976。2.7总峰splc-esims/ms分析2.7.1备方法色谱条件（进样量除外）和对照品溶液、供试品溶液制备方法同2.1～2.3。质谱条件为sensitivity模式，低能通道碰撞电压4eV，高能通道碰撞电压25～45eV，采用全信息串联质谱（MS2.7.2成分指认，确定药材成分总离子流色谱图见图5，采用数据库对比并结合相关文献分析进行成分指认，结果指认了22个成分，均来源于人参、黄芪、甘草、生姜4味药材。以峰6,5,16为例进行裂解途径解析，6号峰的相对分子质量418，与甘草苷相同，查阅文献3指纹图谱的选择《简明医彀》中保元汤煎煮方式仅记载“水煎服”，但在该书卷一要言煎丸服法中载：“煎药大法：每剂水二钟，煎八分。渣用水钟半，煎七分……”，后世医书如《医宗金鉴》保元汤物质基准的化学成分较复杂，但主要为皂苷类物质，本研究采用二极管阵列检测器，分别对300,260,237,203nm等不同波长条件下指纹图谱进行了综合分析，发现单一波长下很难对物质基准中整体化学成分同时表征，其中260nm处指纹图谱信息最丰富，但人参皂苷类成分在该波长下检测信号较弱，考虑到人参在保元汤处方中为君药，应尽量将其标志性成分在指纹图谱中体现，经分析，203nm波长条件下人参皂苷类成分检测信号最强，故本研究同时采集了203nm和260nm的指纹图谱。本研究考察了大量不同类型流动相组成对色谱图分离效果的影响：(1)由于203nm波长下很多流动相具有末端吸收，故选择末端吸收较小的乙腈本研究采用UPLC-PDA双波长同时检测方法系统研究了保元汤物质基准指纹图谱，该方法精密度、重复性、稳定性良好，15批物质基准与对照指纹图谱的相似度均>0.90，通过质谱解析指认了22个共有峰，这22个成分来自4味药材（人参、黄芪、甘草、生姜），说明该方法表征了保元汤组分的整体特征，可为经