基于微卫星标记的浙江浆蜂西湖遗传多样性分析

基于微卫星标记的浙江浆蜂西湖遗传多样性分析

浙江丽峰是中国著名的蜂蜜遗传资源。浙江省杭州市嘉湖区的蜜蜂农在意大利蜜蜂的基础上，根据20世纪60年代和80年代对蜜蜂血浆进行了大规模的定向选择，创造了适合西方蜜蜂血浆的王浆产量。浙江浆蜂的原产地在浙江省嘉兴市平湖地区和杭州市萧山一带，因此又被称为“平湖浆蜂”和“萧山浆蜂”。由于原产地处于沿海区和钱塘江畔，在20世纪蜜粉源丰富，交通相对闭塞，隔离条件较好，从而为浙江浆蜂的形成提供了独特的地理生态环境微卫星分子标记技术具有分布广泛、多态性丰富、共显性遗传、侧翼序列相对保守、稳定性好、检测简便等优点，已被广泛用于物种遗传多样性、种群结构、亲缘关系等的分析中，也是评价保种效果的有效分子标记之一1材料和方法1.1工蜂群的制备于2012、2015、2019年分别在浙江省嘉兴市平湖市的30个蜂场每场随机选择1个蜂群，每蜂群随机取30只左右工蜂，放入无水乙醇中，置于-20℃冰箱中保存，备用。所有蜂场饲养的均为浙江浆蜂，且长期定地饲养或者小转地饲养。1.2实验方法1.2.1基因组dna提取取无水乙醇浸泡保存的蜜蜂样本，每群随机取1只工蜂，剪取蜜蜂胸部肌肉，按照细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP1201（北京百泰克生物技术有限公司）的说明和步骤提取蜜蜂总DNA。1.2.2选择和扩展微卫星的分类参考文献1.2.3线条dna序列的扩张和测量使用引物E2(5´-GGCAGAATAAGTGCATTG-3´）和H2(5´-CAATATCATTGATGACC-3´）1.2.4分析片段波峰位置使用GeneMapper4.0软件导出微卫星数据的图谱文件，根据图谱中的波峰位置判断目标片段的大小，并生成Excel格式的数据。使用POPGENE1.32软件使用DNAStar5.0（美国DNAStar公司）对线粒体DNA序列进行拼接。利用DnaSP6.0软件2结果与分析2.1综合卫星位点分析2.1.1多态信息含量浙江浆蜂（平湖）全群的不同微卫星位点的观察等位基因数、有效等位基因数、杂合度和多态信息含量如表2所示。从中可以看出：在全群中共检测到53个等位基因，其平均观察等位基因数（N在所检测的5个微卫星位点中，A14、A107、Ad3和B124的PIC>0.5，说明这些基因位点为高度多态的基因位点，A88为中度多态基因位点。2.1.2优势等位基因频率优势等位基因是群体中最稳定的基因，在某种程度上体现了群体的特征。不同年份各微卫星位点的优势等位基因频率比较结果见表3。从中可知：A107和Ad3的优势等位基因频率在30%左右，A14和B124的优势等位基因频率在50%左右，A88的优势等位基因频率在70%左右。F检验结果显示，P2.1.3不同时期微卫星的遗传多样性浙江浆蜂（平湖）不同年份各微卫星位点的遗传多样性指标数值见表4。从中可知：不同年份不同微卫星位点的观察等位基因数（N2.2色蜂全群的cdd2分析线粒体COⅠ-COⅡ序列分析结果（表5）显示，浙江浆蜂（平湖）全群存在2种单倍型C1a和C2d。在2012、2015和2019年，C1a的分布频率由80.0%上升到93.3%，而C2d的分布频率则由20.0%降低为6.7%。线粒体ND2序列分析结果（表5）显示，浙江浆蜂（平湖）全群存在4种单倍型。在2012、2015和2019年，单倍型N1的分布频率由56.7%升高到90.0%，而单倍型N2、N3、N4的分布频率都逐渐降低，且单倍型N4在2019年的实验样本中没有被发现。3主要遗传多样性微卫星标记评价遗传多样性受到微卫星位点和数目、基因型分型方法、取样等因素影响。选择的微卫星位点和数目不同，反映的遗传信息就不同，获得的等位基因数可能就会有差异。传统的微卫星基因型分型方法是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染相结合，设备简单，成本低，但是误差较大，所以目前一般都采用荧光PCR结合测序仪来判断基因型，以提高实验的准确性。衡量微卫星位点多态性高低的重要指标是多态信息含量（PIC）。当PIC>0.5时，微卫星位点具有高度多态性；当0.25<PIC<0.5时，微卫星位点具有中度多态性；当PIC<0.25时，微卫星位点为低度多态性基因杂合度也称为基因多样度，一般认为，它是度量群体遗传变异的一个最适参数。与观察杂合度相比，期望杂合度受样本取样的影响较小，常用它来度量群体的遗传多样性。当杂合度在0.5～0.8之间则可认为群体具有较高的多样性F检验显示，3个年份间在平均等位基因数、平均观察杂合度、平均期望杂合度、平均多态信息含量等指标上差异均不显著，说明近年来浙江浆蜂（平湖）的遗传多样性较稳定。这可能与浙江浆蜂（平湖）饲养量较大且饲养区域较封闭有关。吉挺等蜜蜂属于一雌多雄的交配方式，即在一个蜂群里所有的工蜂都是同一只蜂王的后代，但是工蜂的父亲则是与蜂王交配的多只雄蜂。西方蜜蜂蜂王一般与10多只雄蜂完成交配浙江浆蜂是在特殊的历史条件和特殊的自然地理环境下，经人工选育而获得的优良蜜蜂资源，具有重要的生产应用和研究价值。但是，随着原产地生态环境的改变，尤其是蜂农老龄化严重，养蜂后继乏人，原产地浙江浆蜂的蜂场数量及蜂群数量正在大量减少，这些都加剧了保护浙江浆蜂资源的紧迫性。浙江浆蜂虽然在我国养蜂生产中大量使用，但一般都是用作杂交亲本。国家级蜜蜂基因库虽然保存了浙江浆蜂，但是由于蜜蜂的群体性和特殊的交配方式，使得设立保护区成为保护蜜蜂资源的最佳方式。平湖作为浙江浆蜂的主要原产地和主要分布区，其自然地理条件和饲养方式非常适合浙江浆蜂资源的保护。目前的研究结果表明，浙江浆蜂（平湖）的遗传多样性较丰富，从而为浙江浆蜂的资源保护提供了有利条件。但线粒体单倍型的逐渐单一化也提出了警示，尤其是在未来，如果蜂场数量和蜂群数量继续大量减少，势必会影响浙江浆蜂（平湖）的遗传多样性水平。因此，建议加大对浙江浆蜂（平湖）的保护力度，一方面支持平湖地区的传统养蜂生产，维持足够的蜂场数量和蜂群数量，同时改善生态环境，尤其是蜜粉源条件；另一方面加强对浙江浆蜂（平湖）资源的监测，在平湖不同地理区域选择蜂场建立监测点，进行持续跟踪监测，以便及时采取更有效