实验4 蛋白透析技术

实验4

透析技术2014-2015学年第一学期研究生现代生物学实验技术陈飞（chenfei@2014-10-274.1膜分离技术4.1.1膜分离的概念：利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为驱动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现分离的一种技术。膜分离属于速率控制的传质过程，具设备简单、条件温和、无相变、处理效率高、节能等优点，非常适合热敏性的生物大分子的分离纯化，同时还兼有浓缩的功能。膜料液水小分子大分子渗透液浓缩液进料液渗透液4.1.2膜分离过程的分类：膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径大小而达到物质分离的目的，故而可以按分离粒子的大小分为以下几类：微滤、超滤、反渗透、透析等。液体中可能存在的主要成分组分分子量/Da尺寸/nm组分分子量/Da尺寸/nm酵母103～104酶104～1062～10细菌300～104抗体300～1030.6～1.2胶体100～103单糖200～4000.8～1.0病毒30～300有机酸100～5000.4～0.8蛋白质104～1062～10无机离子10～1000.2～0.4多糖104～1062～10（1）微滤（Microfiltration,MF）：以多孔细小薄膜为过滤介质，压力为推动力，使不溶性物质得以分离的操作。微滤膜：孔径分布范围在0.025~14μm之间，截留直径为0.02~10μm大小的粒子。特点：是一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞。可应用于消毒、澄清、细胞收集等。如培养基液菌体分离与浓缩，产品消毒等。（2）超滤（Ultrafiltration,UF）：分离介质同微滤膜，但孔径更小，为0.001~0.02μm，分离推动力仍为压力差，截断分子量可变化。特点：一种动态过程，由泵提供推动力，在膜表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的法向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜面平行的切向力，把膜面截流物冲掉。适合于酶、蛋白质等生物大分子物质的分离、浓缩，超滤亲和纯化，血浆分离，脱盐，去热原，在生物工程中应用很广。常规过滤(A)和超滤(B)的示意图

AB（3）反渗透（Reverseosmosis,RO）：渗透：膜（不能透过溶质）两侧压力相等时，在浓度差作用下，溶剂从溶质浓度低的一侧向溶质浓度高的一侧透过的现象。渗透压：渗透现象中，促使水分子透过的推动力。反渗透：在溶质浓度高的一侧施加超过渗透压的压力，使溶剂透过膜的操作。是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在0.1~1nm之间。特点：基本原理为溶解扩散，在高于溶液渗透压的压力作用下，只有溶液中的水透过膜，而所有溶液中的大分子、小分子有机物及无机物全被截留住。主要用于海水脱盐，纯水制造以及小分子产品如乙醇、糖及氨基酸浓缩等。4.2透析原理透析（Dialysis,DS）原理：透析只需要使用专用的半透膜便可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或者缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不停扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度到达平衡为止。水分子大分子小分子透析膜保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或者“透析液”。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度、正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度、正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。透析膜孔径5-10nm，实验室常用透析袋，不适于大规模生物分离过程，但在生化实验室和医学上应用很广：（1）蛋白质的脱盐、去除变性剂、还原剂之类的小分子杂质；（2）也用于置换样品缓冲液；（3）在临床上常用于肾衰竭患者的血液透析。表征透析膜性能的几个参数：孔的性质(包括孔径、孔分布和孔隙度)、水通量、截留率、截断分子量、透析比、抗压能力、pH适用范围、对热和溶剂的稳定性。截留率:膜对溶质的截留能力,以截留率R（rejection）来表示，其定义为：

R＝1－Cp／CbCp和Cb：表示在某一瞬间，透析液和保留液的浓度。