研究生分子医学实验技能实验二

会计学1研究生分子医学实验技能实验二操作流程琼脂糖凝胶板的制备质粒DNA及酶切产物电泳（约1h）（10

μl）酶切操作、保温（1-3h）质粒DNA提取原理与方法、实验操作纯化的质粒DNA（20μl）琼脂糖凝胶电泳结果观察结果分析与问题讨论9月23日9月30日DNA的紫外分光光度法定量测定第1页/共38页实验三：DNA的琼脂糖凝胶电泳实验四：DNA的紫外分光光度法定量测定第2页/共38页实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳第3页/共38页琼脂糖凝胶电泳法凝凝琼胶胶脂电糖泳电是泳分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料:电泳聚丙烯酰胺电泳第4页/共38页一、琼脂糖凝胶电泳的功用第5页/共38页琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。二、实验原理：在pH值为8.0～8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。第6页/共38页三、琼脂糖电泳分离DNA的范围琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。第7页/共38页胶浓（%）溴酚蓝二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb第8页/共38页四、电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（B,elbloenhpomrboub）呈蓝紫色；二甲苯晴（ol,Xclyxceenyan）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。五、影响凝胶电泳的因素第9页/共38页在1、电NDA的线场分状中子双在,大链中小:性pH值下带负电荷的AND向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:、琼脂糖浓度分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与分子量对数成反比。ANDNAD一个2给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。3、DNA分子当的DNA分构子象处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。、电在低电压时线状片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于的片段的分辨率达到最大所加电压不得超过。mc/v5,ANDbk2AND,压电源4第10页/共38页5、嵌入荧染光料染的料存溴在化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。、离电泳缓冲液的组成及其离子强度影响的电泳迁移率。在没有离子存在时如误用蒸馏水配制凝胶电导率最小几乎不移动在高离子强度的缓冲液中如误加×电泳缓冲液则电导很高并明显产热严重时会引起凝胶熔化或变性。AND,,)01(,AND,,)(AND响影度强子6第11页/共38页六七、设前、期材实备料验中提取的质粒DNA和其酶切产物，琼脂糖(Agarose)八、试水剂平式电泳装置电泳仪微量移液枪微波炉或电炉紫外透射仪或凝胶成像系统。,,,,

2、6××电电泳泳载缓样冲缓液冲：称：取52.0％，溴硼粉酸蓝，，并04％加(w/v)蔗入糖，水定溶溶液至（。或lm0001lm02)0.8Hp(ATDEM5.0g5.72g45sirTEBT51 ％30甘油），贮存于℃。4、溴化乙锭溶液母液将配制成用铝箔或黑纸包裹容器储于室温即可。,mlm/g01,EB:E()B3第12页/共38页九21、、取液操5×作TBE缓步冲骤液20ml加称水取至0g4.琼200ml,配脂制糖成,置0.5×于TBE稀0lm02锥释形缓瓶冲中液,加,待入用50ml5.0×。稀释BTE缓冲液,放入微波炉里或(电炉上加)热至琼脂糖全部熔化取,出摇匀此,为％琼08.脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动使,附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜以减少水份蒸发。,、胶板的制备：将融化的琼脂冷却至℃，而后到入06-503 制胶模具（预先插上样品梳子）中，待胶完全凝固后拨出梳子，取出胶块，放入加有×电泳缓冲液的电泳槽内。EBT50.第13页/共38页45、加电样泳：取加样8lDNAμ完品样与后×6,l2μ合上载电样泳液槽混盖匀立,,用微即接量通移液电枪源小。心控加制入电样压品保槽持中在。0-80V,6电流在40mA以上。电泳方向由负极向正极，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。、观察和拍照：在波长为的长波后紫外灯下观察染色后的或已加有的电泳胶板。存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩以免损伤眼睛。,ANDBE。钟501-分色染下温,室中液EB溶μlm/g5.0的入移长毕完mn425泳电在板胶BE的加未：色染76第14页/共38页五 注意事项倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，否则温度太高会使 制板变形胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄 坏点样孔点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多Goodview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔紫外线照射不要太久第15页/共38页第16页/共38页第17页/共38页第18页/共38页第19页/共38页第20页/共38页第21页/共38页1第22页/共38页3M123223M1实验结果酶切后直接进行电泳检测，下图是较好的酶切结果。点样孔细菌基因组DNASC质粒DNALC型质粒DNAOC型质粒DNA细菌RNA第23页/共38页常见问题1、提取的DNA不纯：变性不充分；关键过程反应时间过短；离心时间或速度不够。2、提取的DNA成涂布状：操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作系统有污染。3、与染色体DNA分离不全；变性过程不完全；试剂配置有问题。第24页/共38页紫外分光光度法检测DNA第25页/共38页实验四【掌实握验275型目紫的外】分光光度计的使用；学习用紫外分光光度法测定DNA的含量。分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术。第26页/共38页特点灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差2～5％（1～2％）操作简便快速应用广泛第27页/共38页吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。光学光谱区近紫外

可见

近红外 中红外远红外远紫外（真空紫外）10nm~200nm200nm~380nm380nm第28页/共38页~780nm780

nm~

2.5

m2.5

m~

50

m50

m~300

m电磁波谱氢灯复(阳合光光及钨灯)发射光谱红橙黄绿青蓝紫单色光三棱镜可见光分光光度计光源紫外分光光度计光源高第29页/共38页低有关光学原理第30页/共38页吸收光谱在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱。苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱苯m54n)(2第31页/共38页甲苯)mn262(入射光透射光反射光被物质吸收的光第32页/共38页光吸收基本定律:Lambert-Beer定律ItI0I

I-dIs朗伯定律60)A=lg(I0It)=k1b/(17A=c2k=)ltI/0I(g比尔定律(1852)吸光度bA=lg(I0/It)=kbc介质厚度)mc(第33页/共38页Lambert-Beer定律A或D＝K

C

L吸光度摩尔消光系数

吸收物质的光径（cm）溶液浓度（mol/L）第34页/共38页原理核酸或核苷酸中的碱基共轭双键对0nm62紫外光有特异性吸收，吸收强度与核酸浓度成正比。紫外光谱分析法第35页/共38页分光光度计法定量DNA第36页/共38页取10

l样品DNA，加入4ml0.1xTE对待测DNA样品做1:400稀释。0.1xTE作为空白,在波长260nm、280nm、310nm处调节紫外分光光度计读数至零。g/ml。3