ctDNA简介与Illumina平台文库构建简介

ctDNA简介与Illumina平台文库构建简介ctDNA简介与液体活检NGS应用及常见文库种类常规文库构建详解目标区域捕获技术介绍2015/8/282OutlineMandelandMetaisFrenchjournalDetectedfreeDNAandRNAHighlevelsofCNAinpatientsofpancreaticcancerplasmaDNAlevelsdecreasedafterchemotherapyImportanceofCNAwasrecognizedK-rasandN-rasgenemutationsintheplasmamyelodysplasticsyndromeHighconcentrationsoftumorDNAinplasma(orserum)withvariouscancersAgreatdealofinterestinthesubjectofCNAwiththepathologiesofcancerousandnon-cancerousorigin1940197719941999LastdecadectDNA简介ctDNA也叫循环肿瘤DNA，指人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征（包括点突变，插入，缺失，重排，拷贝数变异）的来自肿瘤基因组的DNA片段ctDNA研究史2015/8/284ctDNA简介ctDNA来源1、来自坏死的肿瘤细胞；2、来自凋亡的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细胞；4、来自肿瘤细胞分泌的外排体ctDNA特征1、含量低：约占整个循环DNA的1%，甚至0.01%；2、高度片段化，呈现170bp的整数倍DNA分子缠绕在组蛋白上，形成核小体，每缠绕一圈刚好大约为170bp2015/8/285ctDNA的研究——Liquid

BiopsyctDNA的优势一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物，可无创的用于肿瘤早期诊断、发展过程监测、预后判断、以及个性化用药指导无创、无损、实时、多次；当不能获得肿瘤组织信息时，可以开展“液体活检”；能够对肿瘤的演化和适应性改变进行监控；能够对肿瘤病人的治疗效果进行实时监控，并进行个性化的治疗方案指导2015/8/286cfDNA的分离血液的采集与运输血清与血浆的分离促凝管自制抗凝管BCT管促凝剂或不添加添加EDTA或柠檬酸钠

抗凝剂

分离血清专用短时间内分离血浆添加EDTA抗凝剂添加防腐剂稳定有核细胞，防止基因组污染常温保存可达14天16000g，10min高速离心，去除细胞碎片可用于提取cfDNA的血浆存于-80℃2015/8/287cfDNA的分离血浆cfDNA的提取过柱法与磁珠法QIAGENQIAampCirculatingNucleicAcidKit每次最多可以提取5ml血浆加入CarrierRNA作用：提高沉降系数；

防止硅膜产生静电作用2015/8/288cfDNA提取后的检测DNA拷贝数：一定质量的DNA中含有的该基因组一整套基因组的数量计算方式：NA*m/M例：求10ng人的DNA中基因组的拷贝数

1、首先计算人基因组的平均分子质量M=3*109碱基*660道尔顿/碱基

2、计算10ng人DNA的物质的量n=10*10-9g/M

3、拷贝数NA*n≈3000拷贝灵敏度再高的检测手段都要结合实际！接近极限的检测灵敏度十有八九是假！2015/8/289cfDNA提取后的检测粗略检测2100-H检测插入片段大小由于提取中添加了Carrier

RNA，会影响Qubit的定量，为了更精准的要求，需要进行qPCR定量Qubit值约为qPCR定量值的2-2.5倍2015/8/2810cfDNA提取后的检测大部分集中在10-15ng/ml提取量低的原因：1、血浆量不足2、冻融次数过多3、保存时间太长基因组污染的原因：1、BCT管收集血液方式不对；2、溶血3、未能去除细胞碎片达不到质控指标大于30ng无基因组污染2015/8/2811测序，二代测序测序就是分析特定DNA片段的碱基排列序列，也就是AGCT的排列方式二代测序Next

generation

sequencing，NGS，通过构建含有特定接头序列的文库来进行大规模的测序技术特点1、边合成边测序；2、读长短，35bp-300bp3、通量高，Xten——1.8T数据量4、价格低，几十亿美元——万元基因组应用基因组从头测序（denovo）、重测序（re-sequencing）、基因组结构分析、转录组测序、表达谱分析、小RNA及非编码RNA测序、表观遗传学研究2015/8/2812文库种类文库：目标DNA经过片段化之后添加测序接头序列之后的小片段DNA的集合2015/8/2813常规文库构建流程一、基因组DNA的片段化二、末端修复三、3’端腺苷化四、连接接头五、PCR富集六、片段选择、纯化出库2015/8/2814基因组DNA片段化根据测序策略的不同，将基因组DNA随机打断成一定大小的片段PE150:200-400bp；PE75:150-250bpLE220S220Covaris破碎法2015/8/2815基因组DNA片段化

A/B

C

D提取量大于100ng：A/B/C：正常建库；D：风险建库提取量小于100ng：A/B/C：正常建库；D：放弃微量建库DNA打断方法：当起始量大于20ng小于100ng时，降解程度属于A、B、C三个等级，为了保证DNA的最少损失，添加CarrierRNA进行辅助打断。Covaris超声随机打断2015/8/2816基因组DNA片段化转座酶打断Illumina：NexteraAgilent：SureSelectQXT快速：90分钟即可完成文库的制备微量：仅需1ngDNA起始量就可完成建库局限：针对降解严重的样本打断情况不好2015/8/2817末端修复形成原因：打断后形成3’或5’突出末端KlenowDNAPolymeraseT4

DNA聚合酶补平5'突出端，形成平末端切除3‘突出端，形成平末端T4

DNA聚合酶3’到5’的外切活性要高于Klenow聚合酶，但Klenow对模板高级结构的抵抗性能较好

T4PNKDNA5’末端的磷酸化，以便进行连接反应，除去3'磷酸基团2015/8/28183’端腺苷化简单的酶促反应作用：在已修复的DNA3’端加上A，为下步TA连接接头做准备Klenow（exo-）：是大肠杆菌DNA聚合酶I的蛋白水解产物。同大肠杆菌DNA聚合酶I一样，具有5‘→3’的DNA聚合酶活性，但失去了5‘→3’外切核酸酶活性2015/8/2819连接接头测序也是一个通过已知序列来测未知序列的过程，测序接头就是其中的已知序列不同的测序仪具有不同的接头序列，甚至同样的测序仪也支持不同的接头序列TP5’5’3’3’RD1

spRD2

spIndex

spIndex

P5P7IlluminaTruseq接头结构Y字型；P5=59nt，P7=61nt；13bp互补配对；P5和P7端用于芯片杂交；RD1

sp，RD2

sp，Index

sp是测序引物结合位置，不同试剂盒会有所不同；3’端含有一个T碱基方便形成TA连接；Index用于区分不同文库。2015/8/2820连接接头T4连接酶，TA连接T4DNAligase是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键。快速连接酶

15min即可连接完成；

过夜连接与15min无区别Illumina建库试剂盒连接接头示意图2015/8/2821连接接头Agilent建库试剂盒连接接头示意图NEB建库试剂盒连接接头示意图特点：

接头没有P5/P7部分，没有Index，

仅有RD1

sp和RD2

sp的一部分特点：环状接头，含有一个U碱基

接头没有P5/P7部分，没有Index，

仅有RD1

sp和RD2

sp的一部分2015/8/2822PCR扩增引物：P5、P7循环数：5-8cycles扩增产物使用1.8倍体积AMPuerXPbeads纯化，去除小片段以及接头如果采用Agilent或者NEB的建库策略，不能使用P5、P7引物，需要使用特定序列的对应引物进行扩增2015/8/2823片段选择，纯化出库胶回收进行片段选择及纯化1、去除未连接的接头及接头自连体；2、筛选合适的size大小进行上机测序500bp250bp出库文库，接头120bp打断后，PE752015/8/2824目标区域捕获目标区域捕获利用序列捕获技术将目标区域的DNA捕捉并富集，结合高通量测序平台进行测序的研究策略。优势:研究区域集中，大大降低测序费用，周期和工作量；适用于高深度测序，发现低频突变。

2015/8/2825液相捕获技术介绍常用的液相杂交捕获试剂主要有Agilent，Roche和Illumina优点缺点Agilent1、周期短2、捕获效率高3、相同测序深度，数据量少1、操作要求高2、成本高3、探针不稳定4、探针的覆盖区域小5、不能多个样品混合杂交Truseq1、成本低2、探针稳定3、探针的覆盖区域大4、可以混合多个样品杂交1、实验流程繁琐，周期长2、捕获效率低3、相同测序深度，数据量多NimbleGen1、成本较低2、探针稳定3、覆盖区域大4、可以混合杂交1、杂交时间长2、捕获效率较低2015/8/2826Agilent捕获简要流程Pre-capturelibraryBlockingoligos杂交缓冲液生物素标记的探针（RNA，120nt）95℃变性解链，65℃退火复性16-24h捕获与洗脱链霉亲和素磁珠与含有生物素的探针结合，高温条件下进行洗脱，去除非特异性片段PCR富集，添加Index；10-12cycles2015/8/2827文库的封闭DNA

insertP5

adapterP7

adapterIndexP5

blockP7

blockIndex

block（1-96）Cot-1

DNA95℃变性解链高度重复区域2015/8/2828120nt

RNA

probe文库的杂交由于探针是RNA探针，在对文库进行封闭之后，加入探针之前，首先要加入RNAase

block来阻断RNA酶的功能，防止RNA降解全部就绪之后，加入杂交缓冲液和RNA探针，进行杂交SureSelectXT需要16-24h；SureSelectQXT需要2个小时Biotin2015/8/2829捕获与洗脱2015/8/2830常见的链霉亲和素磁珠2015/8/2831混合杂交捕获节约探针的成本——每个800元左右；预扩增失败的样本，达不到杂交最低要求目的：尽可能混合均匀，不影响产出方法：根据插入片段大小分布及摩尔数进行等比例混合对于接头和大于1Kb的片段，qPCR是可以定量出来的，但是杂交时候不能计算在内，需要通过2100计算200-1000bp的片段的有效浓度。