基于ssr标记的中国桃种质分子身份证构建

基于ssr标记的中国桃种质分子身份证构建

0世界桃栽培面积和产量[研究意义]中国是世界上重要的桃子生产国家。2008年世界桃总栽培面积和总产量分别为160万公顷和1800万吨,中国分别占48.7%和46.2%1材料和方法1.1近缘品种电子表试材选自国家果树种质郑州葡萄、桃圃保存的237份桃种质,包括140份地方品种、72份育成品种及其近缘野生种25份,种质名称见电子表。1.2提取dna和pcr系统采用CTAB法提取叶片基因组DNA。PCR反应体系为(10µL)0.6µLdNTP(2.5mmol·L1.3数超过9条带根据每对引物对不同品种扩增条带分子量的大小,按从小到大依次编码为1—9,如果总的带数超过9条带,则参考已报道的该引物扩增带大小范围基础上,并兼顾本试验中野生品种的谱带范围进行选择。当扩增带大小在限定范围内,而扩增条带编码超过9条时,将该类带型赋值为0。当引物对某一品种扩增有2个等位基因时,按等位基因碱基数较小的条带编码进行赋值。2结果2.1ssr引物的确定为了使构建的分子身份证的编码体现不同染色体的信息,尽量选择均匀分布在桃8条染色体上的SSR引物,用80对SSR引物对随机挑选的40个品种进行扩增,最终确定16对多态性较高的引物用于分子身份证的构建,这些引物在染色体上的位置参见图1。2.2ssr扩增多态性16对SSR引物对237份桃种质进行扩增,共检测到203个等位基因,平均每对引物对品种扩增的等位基因数是12.7个。其中,UDP98-409对不同品种扩增结果见图2,显示9个品种共有4个等位基因。由于每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大,从而形成其座位的多态性即等位基因的数目不同。16对引物对237份种质扩增的条带数及其多样性指数如表1,从表中可以看出,BPPCT023对品种扩增的等位基因数最少,为5个;BPPCT008最多,为22个。等位基因数超过平均数的引物有BPPCT020、UDP96-013、UDP96-008、BPPCT017、BPPCT008和CPPCT022,等位基因数越多,表明更能反映不同品种的差异。利用GeneticsStatistics3.02.3扩增的谱带范围16对引物对不同种质扩增的等位基因谱带大小分布范围如表2,相同引物在本试验和其它文献中报道的结果有差异。其中,BPPCT028在本试验中扩增谱带大小高于其它文献中的报道结果,BPPCT034、BPPCT007、BPPCT023、BPPCT014、BPPCT008和UDP98-409在本试验中的扩增谱带范围与其它文献报道结果基本相似;BPPCT020、CPPCT005、BPPCT017、UDP98-407、CPPCT022和UDP98-405在本试验中扩增的谱带范围比其它报道的宽;UDP96-013、UDP96-008和CPPCT006在其它文献中报道只扩增出1条带,而在本试验则分别扩增出17、15和8条带。可见16对引物对本试验所用材料扩增的等位基因数和谱带范围基本上均高于前人报道,这与试验所用材料的遗传背景更为丰富有关。由于在本试验中,为了保证分子身份证字符串的每位上只有1个字符,因此,在赋值时只赋1—9,对于等位基因数超过9的引物,采用只考虑其中9条带的方法来进行。同时,在本试验中由于多数种质为地方品种和育成品种,因此,主要选择对这些品种区分能力较高的等位基因,也兼顾野生种特有的等位基因根据等位基因选择与赋值标准,以‘上海水蜜’为例,其在16个引物下的扩增条带只选择位点较小的进行编码,即保证每引物下的编码只有一位数字(图3)。2.4分子身份证编码根据各引物对品种的扩增结果和表3中等位基因的赋值标准,对237份种质赋值,结果显示,其中的202份具有特异的分子身份证编码(表4)。在202份具有特异分子身份证的种质中,有15份种质具有至少1个特异的等位基因位点,因此,仅用1对引物就能与其它种质区分(表5)。其中,辽梅、美人梅1和毛樱桃1有2个特异的等位基因。此外,237份种质中有35份种质不具有特异的分子身份证,即其分子身份证编码在不同品种间出现相同的情况(表6)。2.5人格多样性分析16个引物组合能对237份种质中的202份形成可辨的分子身份证编码,即85.2%的种质得到区分,平均每对引物能区分12.7份种质。由于桃种质共有上千余份,而分子身份证的最终目的是对所有种质均赋予可辨的分子身份证,在本试验中初步构建的种质分子身份证已经有16位,如果继续对更多的品种构建分子身份证,势必增加筛选的SSR引物数量,结果造成分子身份证的位数不断增加,从而影响到分子身份证使用的意义。为此,有必要对本试验初步筛选的引物,继续筛选出其核心引物,达到用最少的引物组合区分最多品种的目的。如表7所示,试验首先去掉多样性指数最低的一批引物BPPCT020、BPPCT014和UDP98-405,其多样性指数分别为0.325、0.350和0.330(表1)。新增加不能区分的品种只有4个,即在此种引物组合的方式下平均每对引物能区分15.2份种质。继续去掉多样性指数较低,同时等位基因数目最少的一批引物BPPCT028、CPPCT006和BPPCT023,其多样性指数分别为0.557、0.591和0.659,扩增等位基因分别为6个、8个和5个(表1)。此时,新增加不能区分的品种共10个,平均每对引物能区分18.8份种质。最后去掉多样性指数较低,但等位基因数在较高的引物CPPCT005和BPPCT007,其多样性指数分别为0.486和0.653,等位基因分别为12个和10个(表1)。新增加不能区分的品种共12个,平均每对引物能区分22份种质。在剩余的引物中,多样性指数最小的引物为UDP98-407,其多样性指数为0.663。如果继续去掉该引物时,则剩余的7对引物能区分156份种质,平均每对引物可区分22.43份种质。即继续去掉引物,每个引物所区分的种质数量增加非常小,且影响到能区分的种质总量。在16对引物中共去掉BPPCT020、BPPCT014、UDP98-405、BPPCT028、CPPCT006、BPPCT023、CPPCT005和BPPCT007等8对引物,其余8对引物共区分176份种质,平均每对能区分22份,不仅每对引物区分种质的数量较高,而且区分种质的总量也有保证,因此可以作为构建分子身份证的核心引物。2.6不同引用的组合对品种的区分3讨论3.1根据等位基因子进行分子身份证的的最优选择在构建指纹图谱或分子身份证时,许多研究者采用的SSR方法只扩增出或只选择其中的1个等位基因,如艾呈祥等同时,研究认为根据等位基因大小进行一定程度的筛选,即不仅考虑它们在栽培种间而且兼顾其在近缘野生种间表现的多态性,对于所有种质进行分子身份证的构建工作是非常重要的。从本研究中可以看出,由于在筛选的123个等位基因中有32个来自近缘野生种,因此,最后不能区分的种质中近缘野生种较少,大部分获得了可辨的分子身份证编码。3.2杂合带型的筛选对于分子身份证编码的方法也值得探讨,王静毅等对于SSR扩增的杂合带型的编码,高运来等同时,SSR引物对不同种质扩增时会出现有2种杂合带型的情况,此时如果仍要对杂合带型分别命名,增加了赋值时读带的复杂程度,也是本研究作者认为对杂合带型不必考虑的原因。本研究认为,分子身份证赋值方法是人为制定的标准,不一定要反映引物扩增的实际结果,本试验最终结果也表明对杂合带型不单独赋值,没有影响到平均每对引物的区分效率。3.3ssr扩增的可行性用于果树种质资源鉴定的DNA分析技术主要有RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)、RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)、SSR和AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)等。多数作物上的研究结果都表明AFLP产生的多态性远远超过了RFLP和RAPD,目前认为是DNA指纹图谱技术中多态性最为丰富的一项技术。然而分子身份证的构建不仅是区分品种,而且要求非常高的可重复性和简便性。SSR技术由于标记方法本身的特性,其在不同品种间每个特定大小的等位基因序列一致,因此重复性高;同时SSR不需要对模板酶切,相对于AFLP操作简单。即便是引物的多态性,从本文可以看出,当所用试材遗传背景丰富时,SSR也有着较高多态性。但SSR用于分子身份证构建也有缺点,即其对亲缘关系非常近的种质很难区分开,这与SSR扩增的目的片段多来自编码基因之间的序列有关。本试验中(表7),新疆蟠桃(有花粉)和新疆蟠桃(无花粉)不能区分,品种来源地相近的品种有时也存在无法用SSR进行区分的情况如:‘甜李光’与‘酸李光’是新疆地方品种,‘五月鲜’与‘六月白’为北方品种群的地方品种,‘吊枝白’与‘陆林水蜜’均为南方硬肉桃,‘肥城红里6号’与‘肥城白里10号’及‘肥城白里17号’是山东肥城桃的不同株系,‘乌达桃’与‘平永桃’均为来自于西南的地方品种,‘西教1号’、‘西教3号’、‘下庙1号’为西北黄肉桃,可能具有较原始的相同基因源。观赏桃碧桃与绯桃二者为近似品种,而‘鸳鸯垂枝’可分离出纯色的‘朱粉垂枝’,‘NJF7’与‘农神蟠桃’是美国新泽西州农业试验站先后推出的姊妹系品种,它们用SSR无法区分尚可理解。‘理想’与‘美味’均是美国农业部1969年育成的品种,二者亲本无太大相关性,而‘哈太雷’是加拿大1974年育成的品种,与‘理想’、‘美味’也无太多的亲缘关系。这3个品种的分子身份证相同则需要进一步的探讨。另外,对于果树来说,种质中存在大量的芽变及姊妹系品种。在本试验中35份不能区分的种质中,有近一半为这样的种质。在将来构建种质圃中的其他种质的分子身份证时势必要先确定一组区分力高的核心引物,然后通过增加其他具有较高区分效率或特异区分能力的引物4最佳引物组合的筛选16个引物组合固然能区分202个品种,但其中15个品种用一个引物就能分开(表5),剩下的187份品种能否用较少的引物组合来分开以达到简便区分的目的。试验首先选出多样性指数最高的引物CPPCT022进行筛选品种,但无一品种能够分开(表8)。继续加入一个多样性指数较高的BPPCT017后,再次筛选有10个品种能区分开。按此法用余下引物依次进行筛选(表8)。第3个组合能分开28个品种,其中有10个是前2个引物分开的,另18个是增加引物后UDP96-008后可分开的品种。从第4-14组引物组合增加能区分开的品种数依次是38、36、18、18、21、6、12、5、2、1、2,共计187个,全部能分开,第14组引物时品种已全部分开以及前