DNA遗传标记简介

DNA遗传标识介绍TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD研发部韩典霖1第1页Contents第一代DNA遗传标识1第二代DNA遗传标识2第三代DNA遗传标识32第2页一、第一代DNA遗传标识-DNA指纹克林顿与DNA指纹3第3页

什么是DNA指纹？

１９８５年，Jeffreys用“限制性片段长度多态性”办法分析人基因组ＤＮＡ，检测到多条谱带，在X光胶片中呈一系列条纹，具有高度个体特异性，犹如人指纹，故称之为“ＤＮＡ指纹”技术。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物不一样个体或不一样种群在DNA构造上存在着差异）多种多样伎俩，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联反复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。多种分析办法均以DNA多态性为基础，产生具有高度个体特异性DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度变异性和稳定遗传性，且仍按简单孟德尔方式遗传，成为第一代遗传标识。但该办法不足之处是技术复杂，周期长，费用高；检测中需放射性物质，限制了广泛应用；检测多态性水平过度依赖限制性内切酶，使多态性减少；DNA量大，分析速度慢。

4第4页13个CODIS基因座以及Amelogenin在染色体上位置示意图二、第二代DNA遗传标识-STR5第5页

在90年代初，包括复旦大学专家金力在内科学家和FBI合作，确定了13个STR，并论证说这13个STR在多种人群中，虽然亲属关系情况下，还是能较好辨别两个人。美国联邦调查局（FBI）公布了13个关键STR位点（简称CODIS），通过群体调查，被证明在各类人群中具有高度多态性，并通过FBI认证，目前已全面应用于各国法医学试验室，进行亲子判定和各类刑事案件犯罪嫌疑人排除和认定，以及大灾难性事故个体认定（如：塌方、矿井爆炸、飞机失事等）。

CODIS起源6第6页短串联反复序列(shorttandemrepeats,STR)或称微卫星DNA反复序列(microsatellite)是由长度为3-7个碱基正确短串连反复序列组成。这些反复序列广泛存在于人类基因组，平均6-10kb就出现一种，长度一般不大于400bp，且绝大多数位于非编码区。这些序列能够通过PCR来检测，扩增区域内反复序列反复次数不一样造成STR位点等位基因分型差异，在电泳分离后，通过放射性同位素，银染和荧光检测可区分不一样基因型。STR具有分布广泛，信息量大，有高度多态性并遵循孟德尔共显性遗传等长处，目前已广泛应用于遗传制图、遗传连锁性分析、亲子判定、疾病基因定位和物种多态性研究、组织移植评价等很多领域。与RFLP技术及PCR-VNTR技术相比，STR分型更适合微量、陈旧和降解样本检查。

什么是STR？7第7页每个STR等位基因数是根据能产生反复次数来定，例如D3S1358，四个碱基次序反复次数有8，9，10，11，12，13，14，15共8种，其等位基因数就是8，这8个等位基因能够产生36种不一样基因型。假设也许基因数出现概率是同样话，例如对D3S1358来说，有36个基因型，那么某个特定人有某种基因型（9，15）概率就是1/36。这样这13个STR不一样基因型产生某个特定基因型组合就是随机概率是8.8x10(-22)。事实上，某个STR不一样基因型在人群中出现概率是不一样；同样基因型，在不一样人群中出现概率也会不一样。因此，要先从人群中做样本调查，建立资料库，建立多种STR基因不一样基因型在不一样人群中稳定概率，然后算出某个特定基因型组合随机出现也许概率。

STR特点AllelesdistinguishablebyPCRproductlength8第8页STR新技术

MiniSTR技术是目前处理高度降解DNA样本一种新方向。通过重新设计引物，减少扩增产物片段长度，使其结合在更接近关键反复序列侧翼序列。理论上，MiniSTR技术设计引物越接近关键反复序列，产生STR等位基因片段长度就越短，对于降解DNASTR分型成功率就越高。9第9页

STR商业应用全球范围内司法机构在办案过程中使用大量DNA个体识别技术，我们一般称作“亲子判定”就是一项详细应用。其中，通过美国FBI和欧洲认证，并广泛被接收DNA个体识别检测试剂供应商有两家：分别为美国普洛麦格（PROMEGACORP）和美国应用生物系统公司（ABI）。目前在中国亲子判定市场额为8亿，全球市场近100亿美金。由于近23年来，中国大量进口这两家公司试剂盒和仪器设备（ABI是世界上最著名DNA测序仪和PCR生产商），为了打破这两家公司技术垄断，国内公司和研究单位也瞄准了这一尤其市场。10第10页2023年Promega公司在全球率先推出经FBI认证一次扩增16个基因座DNA分型商品化试剂盒—PowerPlex16系统。2023年，经FBI同意，升级版PowerPlex®16HS系统可被美国国家DNA索引系统（NDIS）有关试验室所使用，这些试验室参与生成了DNA图谱数据。PowerPlex16HS系统于2023年3月上市，该试剂盒通过优化，可有效提升疑难法医样品检测成功率，简化建立罪犯数据库工作流程。这一新系统带有更强劲反应缓冲液，以及热启动TaqDNA聚合酶，这些特性较好地满足了上述技术需求。法医样品经常具有不利于DNA分型抑制剂，该系统中经优化反应缓冲液提升了对常规PCR抑制剂耐受性，虽然是棘手案件样品，也能得到良好成果。试剂盒性能亦得到了提升，能够对数据库样品进行直接分析，无需DNA纯化，这既能简化建立罪犯数据库工作流程，又能最后提升试验室工作效率。STR商业应用11第11页PromegaPowerPlex16HSSystemPowerPlex16HS系统能够进行16个基因座(15个STR位点和1个性别位点)复合扩增并用三色荧光进行检测.在这些位点中D18S51,D21S11,TH01,D3S1358,PentaE用荧光素标识；FGA,TPOX,D8S1179,vWA和牙釉质蛋白基因用TMR标识；CSF1PO,D16S539,D7S820,D13S317,D5S818和PentaD用JOE标识。所有16个位点在一管中同步扩增，然后通过单一进样或单一泳道进行电泳分析。PowerPlex16HS系统适用于ABIPRISM310，3100和3100-Avant型遗传分析仪，AppliedBiosystems3130和3130xl型遗传分析仪上进行电泳分析。

STR应用领域及商业价值12第12页ABIAmnFLSTRIdentifierPCRAmpFLSTRIdentifilerPCR扩增试剂盒采取最新荧光技术（五色荧光，一种泳道），实现了16个STR位点同步扩增同步检测。在这些位点中D18S51,D19S433,TPOX和vWA用NED染料标识；Amelogenin,D5S818和FGA用PET染料标识；D2S1338,D3S1358,D13S317,D16S539和TH01用VIC染料标识；CSF1PO,D7S820,D8S1179和D21S11用6-FAM染料标识。AmpFLSTRIdentifiler试剂盒主要特点：1.五色荧光技术:五色荧光技术实现了一色荧光标识分子量内标，其他四色荧光标识为待测样品，在维持扩增产物大小不变条件下，有效提升了单个泳道辨别片段数。2.所有16位点PCR扩增产物均不大于350bp，扩增效率及重现性高，支持DNA降解样品扩增。

3.Identifiler试剂盒包括所有16位点STR扩增所需荧光引物，金牌Taq酶及PCR扩增试剂，各位点等位基因梯度DNA标准品。

STR应用领域及商业价值13第13页

中德美联AGCU17+1STR荧光检测试剂盒

STR应用领域及商业价值14第14页三、第三代DNA遗传标识-SNP15第15页人类起源问题中国科学院昆明动物研究所研究员宿兵等人发展了一套Y染色体单核苷酸多态性标识(简称SNP)研究理论，来研究中国人起源问题。为何选用Y染色体？是由于Y染色体从遗传角度来说相对更单纯。我们懂得，每个人都有两套染色体，一套来自爸爸，一套来自母亲。在这些染色体中，Y染色体是男性染色体，只由爸爸一方遗传而来，这就减少了基因突变率，因此通过Y染色体能够更清楚地反应基因遗传“历史轨迹”。16第16页金力他们从中国各地找了近1万例男性随机样本做试验，通过研究发觉，所有样本都只具有M168仅有三种突变。也就是说，这9988例样本中，M89、M130和YAP这3个最古老遗传分子只发生了三种突变：一种突变成了M89T、M130C和YAP-，发生这种突变类型个体最多，有9329例，占93.4%；一种突变为M89C、M130T和YAP-，这种类型百分比占3.7%，有370例；最后一种突变为M89C、M130C和YAP+，有290例，占2.9%。除了这三种突变外，没有其他新突变种类出现。

这个成果和除非洲以外世界其他地域基因分型成果是一致，就是说M168在非洲之外地域没有出现新突变，也都是只出现了这三种突变，只有有新突变样本出现才能说明中国人不一定都是起源于非洲。

因此，金力他们检测这近1万名中国男性样品全都携带有来自非洲“遗传痕迹”，这从另一种角度又支持了非洲起源学说。人类起源问题17第17页

什么是SNP？

SNP是指在基因组上单个核苷酸变异,包括置换、颠换、缺失和插入。从理论上来看每一种SNP位点都能够有4种不一样变异形式,但事实上发生只有两种,即转换和颠换,二者之比为2:1。SNP在CG序列上出现最为频繁,原由于CpG二核苷酸上胞嘧啶残基C是人类基因组中最易发生突变位点，其中大多数是甲基化，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶T。18第18页

SNP特点SNP特点①密度高：在人类基因组中大约每1000个碱基就有一种SNP，总量大约是300万个，密度比微卫星标识更高，能够在任何一种待研究基因内部或附近提供一系列标识。②富有代表性：根据SNP在基因中位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-regionSNPs，cSNPs）、基因周围SNPs（PerigenicSNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（IntergenicSNPs，iSNPs）等三类。某些位于基因内部SNP有也许直接影响蛋白质构造或体现水平。因此，它们也许代表疾病遗传机理中某些作用原因。③遗传稳定性：与微卫星等反复序列多态性标识相比，SNP具有更高遗传稳定性。④易实现分析自动化：SNP标识在人群中只有两种等位型(allele)，故也称为双等位标识(biallelicmarker)。这样在检测时只需一种“+/-”或“全/无”方式，而无须象检测限制性片段长度多态性，微卫星那样对片段长度作出测量，这使得基于SNP检测分析办法易实现自动化。19第19页SNP应用领域

SNP应用领域

1.遗传图谱绘制标识

2.疾病诊断和疾病易感基因鉴别

通过研究某些基因单核苷酸多态性出现频率与个体患病之间有关性，来鉴别疾病易感基因。

3.药品基因组学研究和新药筛选

疾病某些主要易感基因能够作为治疗该疾病靶基因，来进行新型治疗药品设计和筛选。

4.药品代谢和药品遗传学

通过研究遗传多态性尤其是单核苷酸多态性与个体对药品敏感性或耐受性有关性,能够说明遗传原因对药品效用影响,从而对个体化用药和药品开发提供指导和依据。

5.法医判定和个体识别

和其他多态性标识同样，SNP可用于法医判定和个体识别，如亲子判定。长处是低突变率,稳定遗传，可用高通量办法自动分型。

6.群体遗传学研究和遗传多态性分析

SNP位点丰富、稳定且容易对SNP进行自动化基因分型，可有效迅速地分析基因型和表型之间关系。故SNP已经成为群体遗传学研究中关键成份。

7.物种判定、菌种判定

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HapMap

国际人类基因组单体型图计划（TheInternationalHapMapProject）是继国际人类基因组计划之后人类基因组研究领域又一种重大研究计划。HapMap计划起始于2023年，由美、加、中、日、英、尼日利亚等国研究机构发起、参与及完成。项目共取样270个正常个体，其中欧洲30个三联家系，亚洲45个中国人，45个日本人，非洲30个三联家系。一期计划于2023年完成，共成功分型100多万个多态性位点，也称单核苷酸多态性（SNP）位点，全基因组平均3kb一种SNP位点。二期数据共成功分型300多万个SNP位点，密度约为一期数据3倍，构建起一张精度更高信息更完整多人种遗传多态图谱。能够说正是这些遗传多态位点存在，在遗传体质上，你我之间有了个体差异，不一样人种之间有了种群差异。HapMap构建分为三个步骤：（a）在多种个体DNA样品中判定单核苷酸多态性（SNPs）；（b）将群体中频率大于1%那些共同遗传相邻SNPs组合成单体型；（c）在单体型中找出用于识别这些单体型标签SNPs。通过对图中三个标签SNPs进行基因分型，能够确定每个个体拥有哪一种单体型。