专题35微生物的培养技术及应用（串讲）

专题35微生物的培养技术及应用考点分布重点难点备考指南1.微生物的分离和培养2.某种微生物数量的测定理解掌握微生物各种分离原理和方法。理解并掌握微生物数量测定的步骤和注意事项。掌握培养基的选择方法。考点一微生物的基本培养技术1．培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。培养基按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。2．无菌技术的目的是获得纯净培养物。关键是防止外来杂菌的入侵。常用方法有灭菌和消毒。灭菌桶装入待灭菌物品不要装太挤的原因是避免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。加热灭菌锅时应打开排气阀，目的是排除锅内冷空气，之后，才能关上排气阀。3．纯化培养的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。菌落是由单个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。平板划线法分离纯化大肠杆菌的步骤：①接种：在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，在摇床上37℃下振荡培养12h。②划线分离：用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中沾取菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿。③培养观察：将培养皿倒置，放在37℃恒温箱中培养12～24h后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落。4.微生物的接种方法除平板划线法和稀释涂布平板法外，还包括斜面接种、穿刺接种等方法。微生物接种的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。5.(1)平板冷凝后，要将平板倒置，原因是可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；避免培养基水分过快挥发。(2)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板不能用来培养微生物，原因是空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，可能会造成污染。(3)平板划线法在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，原因是划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。1．（1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基eq\x(计算)→eq\x(称量)→eq\x(溶化)→eq\x(调pH)→eq\x(灭菌)→eq\x(倒平板)（2）纯化大肠杆菌的方法①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。②稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。操作步骤：②涂布平板操作步骤3．选择培养基与鉴别培养基的比较项目选择培养基鉴别培养基制备方法培养基中加入某些化学物质培养基中加入某种指示剂或化学药品原理依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好或抗性而设计产生特定的颜色或其他变化用途从众多微生物中分离出所需的微生物鉴别不同种类的微生物项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体化学药剂消毒法用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属用具高压蒸汽灭菌法培养基及容器的灭菌项目平板划线法稀释涂布平板法分离结果关键操作接种环在固体培养基表面连续划线①一系列的梯度稀释②涂布平板操作接种用具接种环涂布器注意事项(1)接种环的灼烧：①第一次划线前，避免接种环上可能存在的微生物污染培养基；②再次划线前，杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种直接来源于上次划线的末端；③划线结束后，杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。(2)接种环灼烧后，要冷却后才能接触菌液，以免温度太高杀死菌种。(3)划线时用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破(1)在进行稀释操作时，每支试管及其中的9mL水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离酒精灯火焰1～2cm处。(2)涂布平板时：①涂布器用体积分数为70%的酒精消毒，取出时要让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃；②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精；③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管头不要接触任何其他物体优点可以观察菌落特征，对混合菌进行分离可以计数，可以观察菌落特征缺点不能计数操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延共同点都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征典例1.高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选出了能高效生产高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如下图所示。请据图回答下列问题：（1）Ⅰ号培养基从物理状态来看，属于固体培养基，配制时要加入________________作为凝固剂，从用途来看属于选择培养基，应以________________作为唯一碳源。（2）配制固体培养基的基本步骤是（）A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板（3）溶化时，烧杯中加入琼脂后要不停地____________，防止琼脂糊底引起烧杯破裂。对培养基灭菌的方法一般为____________________。（4）过程①是________________，过程②所使用的接种方法是________________法。（5）部分嗜热菌在Ⅰ号培养基上生长时可释放________分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈，挑选相应的菌落，接种到Ⅱ号培养基进一步分离纯化后，再对菌种进行____________培养。【答案】（1）琼脂淀粉（2）C（3）搅拌高压蒸汽灭菌（4）稀释涂布平板（5）淀粉酶扩大【解析】（1）固体培养基中通常加入琼脂作为凝固剂。本实验的目的是获得生产高温淀粉酶的嗜热菌，故其选择培养基中应以淀粉作为唯一碳源。（2）配制固体培养基的基本步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（3）配制培养基加热溶化时，要注意加入琼脂后要不断搅拌，防止琼脂糊底。对培养基的灭菌一般采用高压蒸汽灭菌法。（4）仔细观察题图可知，过程①是菌液稀释，过程②是采用涂布平板法接种。（5）能产生淀粉酶的部分细菌能分解利用淀粉，其菌落周围会出现透明圈，取这样的菌落再分离纯化可获得相应菌种，以后可以对菌种进行扩大培养用于生产。典例2.鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生一些硫化氢等硫化物。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。请回答相关问题：(1)培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是________。要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在__________________________________________________________________________________________________，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌，所以称为________培养基。(2)在分离“鲸落”中的微生物时要制备固体培养基，在倒平板操作后，将平板倒置，这样做的目的是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)为了研究“鲸落”中含有微生物的情况，需将“鲸落”提取物加水稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这种方法称为________________。下面所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是________。(4)若想得到“鲸落”中某目标菌种，可用平板划线法进行纯化。若下图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为________。图甲中的③更易获得单菌落，判断依据是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。【答案】(1)含碳有机物(或脂肪)碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物选择(2)防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染；防止培养基水分蒸发过快(3)稀释涂布平板法D(4)丙每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更容易获得单菌落【解析】(1)厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，属于异养微生物，故培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是含碳有机物(或脂肪)。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物，即硫细菌为自养生物，所以要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物。这种人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基为选择培养基。(3)使用涂布器涂布接种微生物的方法为稀释涂布平板法。稀释涂布平板法接种的微生物会在培养基上形成均匀分布的菌落，而平板划线法接种的微生物在划线的起始部分菌落连在一起生长，由图可知，A、B、C均形成了均匀分布的单个菌落，属于稀释涂布平板法接种的，而D中菌落是连在一起生长的，是通过平板划线法接种的。考点二微生物的筛选和计数1．筛选菌株的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。2．微生物计数可以用活菌计数法（统计菌落数目）和显微镜直接计数法3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。(2)统计菌落数目：统计样品中的活菌数目一般用稀释涂布平板法。(3)计算：根据公式“每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M[C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数]”进行计算(4)分解尿素的细菌的鉴别①方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。②原理：分解尿素的细菌可以产生脲酶，能把尿素分解成CO2和NH3③实验现象及结论培养基变红：该种细菌能分解尿素。培养基不变红：该种细菌不能分解尿素。测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌数目，选用的稀释范围不同，分离不同微生物采用的稀释度不同。由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境。项目间接计数法(稀释涂布平板法)直接计数法(显微镜计数法)原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量公式每克样品中的菌落数＝eq\f(C,V)×M每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数缺点当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落不能区分细胞死活结果比实际值偏小比实际值偏大注：细菌的数目还可以通过滤膜法来测定。2．微生物的筛选与鉴别方法(1)微生物的筛选方法单菌落挑取法利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物选择培养法利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物鉴定培养法利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物(2)微生物的鉴别方法菌落特征鉴别法根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别指示剂鉴别法如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素染色鉴别法如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来鉴别分解纤维素的微生物(1)两种对照组的设置及作用①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。(2)重复组的设置及作用：为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置至少3个平板作重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。典例1.(2020·吉林长春实验中学期末)科学家从羊等食草动物胃中筛选纤维素分解菌，并对其降解纤维素的能力进行了研究。请回答下列问题：(1)若科学家在____________平板上，发现以某种菌的菌落为中心的透明圈，则表明此种菌为纤维素分解菌。(2)在纤维素分解菌的培养过程中应保持恒温箱中的温度约为________(填“4℃”“20℃”或“35℃”)。科学家采用稀释涂布平板法分离、纯化纤维素分解菌。在实验前，需要使用__________________法对培养基进行灭菌；在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，目的是__________________________________________________________。(3)在接种的过程中，需要使用________(填“接种环”或“涂布器”)进行接种。科学家欲将筛选得到的纤维素分解菌进行大量培养，应选用________(填“液体”或“固体”)培养基，并以________为唯一碳源，配制此培养基时，________(填“能”或“不能”)使用牛肉膏作为氮源。【答案】(1)纤维素刚果红培养基(2)35℃高压蒸汽灭菌检测培养基平板灭菌是否合格(3)涂布器液体纤维素不能【解析】(1)用纤维素刚果红培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的透明圈。(2)4℃、20℃、35℃三个温度中，35℃最接近纤维素分解菌的生活环境——羊胃的温度，故培养过程中应保持恒温培养箱中的温度约为35℃。培养基灭菌一般用高压蒸汽灭菌法。在接种之前，要随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。(3)科学家采用稀释涂布平板法分离、纯化纤维素分解菌，故需要使用涂布器进行接种。典例2.(2020·四川乐山市调研)尿素是一种重要的农业肥料，经微生物分解后能更好地被植物利用。某生物兴趣小组试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计实验并成功筛选到能高效分解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示。KH2PO4Na2HPO4MgSO4·7H2O葡萄糖尿素琼脂1.4g2.1g0.2g10g1g15g将表中物质溶解后，用蒸馏水定容到100mL。实验过程如图所示：回答下列问题：(1)该培养基为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型包括___________________________________________________________________________________________________(答出两点即可)。能筛选出目的菌的原因是________________________________________________________________________________________________________________________。(2)图中将细菌接种到固体培养基上时，采用的方法是______________。初步筛选出来的菌种还需要进一步的鉴定：在培养基中加入________指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成________色，则可说明该菌种能够分解尿素。(3)在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是_______(填序号)，需要消毒的是_______(填序号)。①培养细菌的培养基与培养皿②玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管③实验操作者的双手(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行________处理后，才能倒掉。【答案】(1)碳源、氮源(无机盐、水)该培养基以尿素为唯一氮源(2)稀释涂布平板法酚红红(3)①②③(4)灭菌【解析】(1)该培养基为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型包括碳源、氮源、无机盐、水。能筛选出目的菌的原因是该培养基以尿素为唯一氮源。(2)图中将细菌接种到固体培养基上时，采用的方法是稀释涂布平板法。尿素分解菌可以用酚红指示剂进行鉴定，原因是其体内产生的脲酶能够催化尿素分解为氨，使酚红指示剂变成红色。(3)培养细菌的培养基与培养皿、玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管都需要进行灭菌处理；实验操作者的双手需要进行消毒。(4)为避免污染环境，使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉。1.（2023·北京·统考高考真题）高中生物学实验中，下列实验操作能达成所述目标的是（）A．用高浓度蔗糖溶液处理成熟植物细胞观察质壁分离B．向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境C．在目标个体集中分布的区域划定样方调查种群密度D．对外植体进行消毒以杜绝接种过程中的微生物污染【答案】A【解析】A、成熟的植物细胞有中央大液泡，用高浓度蔗糖溶液处理，细胞会失水，成熟植物细胞能发生质壁分离，因此用高浓度蔗糖溶液处理成熟植物细胞观察质壁分离，A正确；B、向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无氧环境，不能创造无菌环境，B错误；C、在用样方法调查种群密度时，应该做到随机取样，而不是在目标个体集中分布的区域划定样方调查种群密度，C错误；D、对外植体进行消毒可以减少外植体携带的微生物，但不能杜绝接种过程中的微生物污染，D错误。故选A。2.(2020·山东，20)野生型大肠杆菌可以在基本培养基上生长，发生基因突变产生的氨基酸依赖型菌株需要在基本培养基上补充相应氨基酸才能生长。将甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独接种在基本培养基上时，均不会产生菌落。某同学实验过程中发现，将M、N菌株混合培养一段时间，充分稀释后再涂布到基本培养基上，培养后出现许多由单个细菌形成的菌落，将这些菌落分别接种到基本培养基上，培养后均有菌落出现。该同学对这些菌落出现原因的分析，不合理的是()A．操作过程中出现杂菌污染B．M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸C．混合培养过程中，菌株获得了对方的遗传物质D．混合培养过程中，菌株中已突变的基因再次发生突变【答案】B【解析】据题意可知，甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独培养时均不会在基本培养基上出现菌落，两者混合培养一段时间后，再接种在基本培养基中却出现菌落，除了操作过程中出现杂菌污染，杂菌在基本培养基上生长形成菌落的原因以外，还可能的原因是菌株获得了对方的遗传物质，或菌株中已突变的基因再次发生突变，使突变菌株能产生所需的氨基酸，而变成了非依赖型菌株，从而能在基本培养基上生长形成菌落，A、C、D项正确；M、N菌株混合培养一段时间，稀释涂布到基本培养基上后，培养出现的菌落是由单个细菌形成的，菌落中不可能有M、N菌株同时存在而互为对方提供所缺失的氨基酸，故B项错误。3.(2020·浙江7月选考)下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是()A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pHC．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒D．适宜浓度的酒精可使醋酸菌活化【答案】A【解析】以尿素为唯一氮源的固体培养基是选择培养基，让能利用尿素的微生物生长，其他微生物不能生长，但不能迅速杀死其他微生物，A项错误；不同微生物生长的适宜pH不同，如培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将培养基的pH调至中性或微碱性，B项正确；酵母菌酿酒时直接利用的物质是葡萄糖，因此酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒，C项正确；醋酸发酵时，适宜浓度的酒精可使醋酸菌活化，较高浓度的酒精会抑制醋酸菌的活化，D项正确。4.（2023·山东·高考真题）平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是（

）A．不含氮源的平板不能用于微生物培养B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物【答案】D【解析】A、不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；B、平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；C、使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；D、脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。故选D。5.(2020·全国Ⅰ，37)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。回答下列问题：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用__________________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是_________________________________________________(答出1点即可)。(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：_________________________________________________________________________________________________。(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即__________________________________________________________________________________________________________________________________________________。【答案】(1)高压蒸汽灭菌琼脂选择(2)104(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数(5)水、碳源、氮源和无机盐【解析】(1)微生物培养过程中，培养基的灭菌通常采用高压蒸汽灭菌的方法。乙培养基为固