微生物实验报告公开课一等奖课件省课获奖课件

微生物试验报告产青霉素酶杆菌分离、优化、诱导及酶活测定第1页一二三四点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本目录试验成果试验操作分析讨论介绍第2页一、介绍枯草芽孢杆菌广泛分布于土壤及腐败有机物中，易在枯草津汁中繁殖而得名。本试验中通过从土样中取得枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。枯草芽孢杆菌可产生青霉素酶，并且青霉素和磷酸盐对其有诱导作用，本试验中通过青霉素对其诱导，从而进行菌种优化。第3页一、介绍青霉素酶是β-内酰胺酶1种,其作用机理是水解β-内酰胺类抗生素β-内酰胺环，使抗生素失去其活性，是致病菌产生耐药性主要原因之一，因此对青霉素酶研究在青霉素用于临床很快便全面展开了。人们在研究青霉素酶过程中，除了发觉它有害一面外，也发觉了某些有利方面。如:在β-内酰胺类抗生素药品质量检查中，利用青霉素酶进行无菌检查是一种非常有效、简便、快捷办法，可定量检查出青霉素类药品中污染微生物程度。因此研究青霉素酶有了另一番意义。青霉素作诱导剂使用，细胞上特殊接收体与青霉素结合成份(penicillin2bindingcomponent,PBC)相同，可用青霉素结合成份与诱导剂“亲和力”不一样来解释青霉素酶产率高低。PBC与诱导剂相结合是青霉素酶合成过程中很主要影响原因之一。第4页二、试验过程如图为大体操作过程第5页二、试验过程

试验日程4月8日青霉素浓度梯度平板制备，斜面培养基配制，灭菌。4月9日采集土壤样品及土壤样品处理，将所得试验所用菌液用平面

涂布法接种到做好培养皿上，放入37℃恒温培养箱培养24h。4月15日镜检。挑取杆菌接种到10单位梯度培养基上。4月22-5月5日优化菌种。增加青霉素素浓度度从10、20、50、100、500、

1000、2023、5000、10000、20230单位进行反复优化，

增加枯草芽孢杆菌产酶能力，并将10000万单位菌种进行斜面保存。5月6日-13日摇瓶发酵。对上面得到10000单位菌种进行发酵培养，并

对发酵液稀释后进行酶活测定。5月13日-17日菌株诱变5月20日将一万单位保存菌种放入1000、2023、4000、8000、

10000单位青霉素液体培养基中进行培养并观测菌种生长情况第6页二、试验过程①器材：37℃恒温培养箱、恒温摇床、分析天平、碱式滴定管、高压灭菌锅、接种环、三角瓶、移液枪、注射器、培养皿、三角棒、酒精灯、移液管、洗耳球、恒温水浴锅、电磁炉、电磁锅、烘箱等。②材料：土壤（30教旁草地土）160万单位/0.96g青霉素、硫代硫酸钠固体、碘固体、可用性淀粉。第7页二、试验过程细菌培养基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化钠4g

蒸馏水1000mL（若为固体培养基，加20g琼脂），pH7.4

斜面培养基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化钠4g

琼脂20g

蒸馏水1000mL,pH7.4第8页二、试验过程发酵培养基：蛋白胨15g甘油50g

氯化钠4g0.1％硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液0.5ml

枸橼酸钠5.88g20％硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液1ml

磷酸氢二钾4g肉浸液1000ml

对于上面3种培养基，为了合适枯草芽孢杆菌生长和产酶，进行pH调整。灭菌后pH7.0～7.2（由于灭菌后不好调pH，因而灭菌前调pH7.2～7.4，查资料知灭菌后pH降0.2左右）第9页点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本

二、试验过程从土壤中分离菌种并接种培养

涂布培养青霉素浓度梯度平板制备青霉素溶液制备处理土样，取得菌液第10页点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本

二、试验过程菌种筛选镜检水洗干燥染色固定涂片菌种筛选第11页二、试验过程细菌培养基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化钠4g

蒸馏水1000mL（若为固体培养基，加20g琼脂），pH7.4

斜面培养基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化钠4g

琼脂20g

蒸馏水1000mL,pH7.4第12页二、试验过程菌种优化

10单位保存菌种（1万单位）500、1000

单位（固液）20、50、100单位1万、2万单位斜面培养基配制：配制150ml斜面培养基（配方见试验材料）、倒入试管中（约占试管1/3体积），121℃高压灭菌30min。待培养基冷却到45℃左右后，摆成斜面后备用。第13页二、试验过程摇瓶发酵1、配制100ml液体发酵培养基3个，121℃灭菌30min，配方如上面试验材料，然后加入加入上述配得10万单位青霉素溶液10ml，得到1万单位青霉素液体发酵培养基。2、将保种1万单位青霉素接种到发酵培养基上，放入恒温摇床培养24h。3、观测个培养基浑浊成度。9、对发酵液处理，进行下面酶活力测定。第14页二、试验过程青霉素酶活力测定准备工作：1、青霉素酶溶液制备2、磷酸盐缓冲液(pH7.0)制备3、醋酸钠缓冲液(pH4.5)4、碘滴定液制备5、硫代硫酸钠滴定液配制6、青霉素溶液配制第15页二、试验过程测定：试验组：精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃精确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取碘滴定液(0.01mol/L)［精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度］25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉批示液，继续滴定至蓝色消失。空白组：取已预热青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。第16页二、试验过程计算办法：E＝(B－A)×M×F×D×100

E为青霉素酶活力，单位／(ml.小时)；B为空白滴定所消耗上述硫代硫酸钠滴定液容量，ml；A为样品滴定所消耗上述硫代硫酸钠滴定液容量，ml；M为硫代硫酸钠滴定液浓度，mol/L；F为在相同条件下，每1ml上述碘滴定液(0.01mol/L)相称于青霉素效价单位；D为青霉素酶溶液稀释倍数。

第17页紫外诱变繁殖体取得点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本二、试验过程倒、涂平板菌株诱变25℃培养第18页二、试验过程再摇瓶培养由于诱变未得到想要菌种，为证明取得了耐1万单位/ml菌种，对保存1万单位菌种进行摇瓶培养观测成果。1.配制5管5ml液体培养基，灭菌冷却。2.分别加入0.5ml、0.4ml、0.2ml、0.1ml、0.05ml,10万单位青霉素溶液，得到10000、8000、4000、2023、1000单位青霉素培养液。3.挑去保存10000单位菌种接种后，37℃，摇瓶培养24h观测菌种生长情况。第19页三、试验成果筛选成果第20页三、试验成果菌种优化成果第21页三、试验成果酶活力测定成果三个发酵培养菌液进行测酶活，对比后酶活最大一种。发酵培养基酶活力：①成果数据统计：稀释1000倍D=1000B-A=0.2ml硫代硫酸钠滴定B液浓度0.01mol/L（经硫代硫酸钠直接滴定碘精确测出浓度）碘滴定液浓度0.01mol/L②计算：E=(B－A)×M×F×D×100=0.2×0.01×742×1000×100=148400单位／(ml.小时)