生物制药 抗体药物公开课一等奖课件省赛课获奖课件

第四章抗体制药张忠山第1页第一节概述第二节单克隆抗体及制备第三节基因工程抗体及制备第四节多功能抗体及制备第五节抗体工程第六节抗体诊断试剂第七节抗体治疗药品第2页第一节概述1、免疫学发展经历免疫学是一门既古老而又新兴科学。免疫学发展是人们在实践中不停摸索、不停总结和不停创新成果。一般以为免疫学发展经历了四个时期即经验免疫学时期、典型免疫学时期、近代免疫学时期和当代免疫学时期。

第3页经验免疫学时期：早在公元11世纪，我国医学家在实践中发明性地发明了人痘苗，即用人工轻度感染办法预防天花。在明代隆庆年间（朱载垕，1567～1572），人痘苗已在我国广泛应用。第4页至17世纪，人痘苗接种预防天花办法引发邻国注意，先后传入俄国、朝鲜、日本、土耳其、英国等地，进而使人痘苗预防天花办法得以推广和验证。此即经验免疫学时期。它是人类结识机体免疫性开端，为后来英国医生Jenner（琴纳）发明牛痘苗奠定了基础。该时期发觉了免疫现象，对医学实为一项伟大奉献。第5页典型免疫学时期：18世纪至20世纪中叶为典型免疫学时期。这一时期，人们对免疫功能结识由人体现象观测进入了科学试验时期。在此期间取得主要成果包括：（1）牛痘苗发明：患过牛痘挤奶工不再患病第6页（2）减毒活疫苗发明：19世纪末，法国免疫学家巴斯德（Pasteur）和德国细菌学家柯赫（Koch）在创建了细菌分离培养技术基础上，通过系统地科学研究，利用物理、化学，以及生物学办法取得了减毒菌苗，并用于疾病预防和治疗。Pasteur以高温培养法制备了炭疽疫苗，用狂犬病毒在兔体内经连续传代制备了狂犬病疫苗。这些减毒疫苗发明不但为试验免疫学打下了基础，也为疫苗发展开辟了新局面。

第7页（3）抗体发觉：1890年德国学者Behring（贝苓）和日本学者北里用白喉外毒素免疫动物时发觉，在被免疫动物血清中有一种能中和外毒素物质，称为抗毒素。将此免疫血清被动转移给正常动物，使后者取得了中和外毒素能力。同年Behring又与北里将白喉抗毒素正式用于白喉治疗，开创了人工被动免疫疗法之先河。为此，Behring于1923年取得诺贝尔医学和生理学奖。第8页后来，人们相继发觉了凝集素、沉淀素等能与细菌或细胞特异性反应物质，统称为抗体；而将能引发抗体产生物质称为抗原，从而确立了抗原和抗体概念。免疫抗原；反应抗原第9页第10页第11页近代免疫学时期：生物体免疫反应性有了比较全面结识，出现了全新免疫学理论。包括迟发性超敏反应、免疫耐受发觉、细胞系选择学说提出、免疫学技术发展。第12页当代免疫学时期：在这一时期，确认了淋巴细胞系在免疫反应中地位，说明了免疫球蛋白分子构造与功能。第13页第14页免疫球蛋白第15页有关概念抗体是指能与对应抗原特异性结合具有免疫功能球蛋白。抗体产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌球蛋白。第16页

T淋巴细胞第17页

B淋巴细胞第18页2、抗体药品发展1890年：Behring和北里柴三郎等发觉了白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。白喉杆菌第19页1937年：Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（）球蛋白和丙种（）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。第20页20世纪60年代早期：抗原决定簇，精制单价血清。1975年：Köhler和Milstein等，单克隆抗体，其具有高度特异性、均一性，以及起源稳定可大量生产等特点。1984年：人-鼠嵌合抗体（30:70)1984年至今：单克隆抗体鼠源性及分子过大问题得以处理，可仅作为与抗原特异性结合试剂。第21页特殊化学基团

喉类毒素：8个，流感病毒：40多种抗原决定簇第22页单克隆抗体和多克隆抗体制备抗原脾B淋巴细胞融合融合淋巴细胞骨髓瘤细胞克隆1克隆2克隆3克隆4第23页

3、单克隆抗体应用用于疾病诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某些疾病有关抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标识单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫判定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有分化抗原CD3单克隆抗体，用作免疫抑制剂。第24页单克隆抗体还可作为载体制备导向药品。不过要处理下列两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体免疫原性；（2）完整抗体分子分子量过大（10万以上），难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效治疗浓度。第25页处理措施：(1)减少单克隆抗体免疫原性；(2)减少单克隆抗体相对分子质量。

第26页第二节单克隆抗体及其制备1、抗原与动物免疫2、细胞融合与杂交瘤细胞选择性培养3、筛选阳性克隆与克隆化4、杂交瘤细胞与抗体性状判定5、单克隆抗体大量制备6、单克隆抗体纯化第27页1、抗原与动物免疫（1）制备用于动物免疫合适抗原。a、化学合成抗原，如精制地高辛。b、多数情况下抗原物质只能得到部分纯化，甚至是极不纯混合物，如部分纯化干扰素。c、通过克隆化选出最合适单克隆抗体。第28页在制备恶性肿瘤细胞表面抗原单克隆抗体时，情况较复杂，需用整个肿瘤细胞做为免疫原，通过筛选、克隆化，制备出仅存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞上表面标志分子上单克隆抗体。第29页（2）稳定杂交瘤取得因免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远，产生杂交瘤越不稳定，故一般采取与骨髓瘤供体同一品系动物进行免疫。目前常用骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因此免疫动物也多采取对应品系，最常用也是BALB/c小鼠。

BALB/c小鼠：1923年美国培育，1985年引进我国。Lou大鼠：1972年美国培育，1985年引进我国。第30页（3）免疫办法：体内免疫法和体外免疫法

体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8-12周龄雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌、细胞抗原）免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔1-3周，再追加免疫1-2次，可溶性抗标准按每只小鼠10-100

g抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2-4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1-2次。第31页体外免疫法：所需要抗原量少，一般只需几个g，免疫期短，仅4-5天，干扰原因少，已成功制备出针对多种抗原单克隆抗体，但融合后产生杂交瘤细胞株不够稳定。其基本办法是用4-8周龄BALB/c小鼠脾脏制成单个细胞悬液，再加入合适抗原使其浓度达0.5-5g/mL，在5%CO2、37℃下培养4-5天，再分离脾脏细胞，进行细胞融合。第32页2、细胞融合与杂交瘤细胞

选择性培养（1）细胞融合基本办法：取适量脾细胞（1×108）与骨髓瘤细胞（2×107-3×107）进行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液迟缓稀释。第33页（2）用于融合骨髓瘤细胞应具有条件：融合率高，本身不分泌抗体，所产生杂交瘤细胞分泌抗体能力强且长期稳定等特点。第34页（3）诱导剂PEG影响：分子量及浓度越大，促融率越高，但其粘度和对细胞毒性也随之增大。目前常用PEG浓度为40%-50%，相对分子质量以4000为佳。为了提升融合率，在PEG溶液中加入二甲基亚砜（DMSO）。但必须严格限制它们和细胞接触时间，可通过低速离心5min使细胞接触更为紧密，然后用新配制培养液来稀释药品并洗涤细胞。第35页细胞融合后可产生多种融合，脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合细胞，以及未融合细胞。

（4）培养基正确选择：常用选择培养基为HAT培养基，它是次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制。第36页（5）选择性培养办法：细胞悬浮96孔板换液（HAT培养液）改用HT培养液一般RPMI1640完全培养液。从融合后8-9天就可对所有克隆生长孔培养上清进行抗体检测，筛选出产生抗体阳性克隆。第37页（6）饲养细胞：由于在最适条件下大约有105个脾细胞才能形成一种杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡，单个或少数杂交瘤细胞多半不能存活，因此一般要加入饲养细胞才能使其繁殖。常用饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。第38页3、筛选阳性克隆与克隆化（1）筛选阳性克隆：由于产生特定抗原抗体产生细胞只占所有脾细胞5%左右，因此要进行每孔培养上清抗体活性筛选工作，以选择出阳性克隆，然后进行克隆化培养。常用检测办法有免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术等。第39页1、精制破伤风毒素抗原（）吸附（约10g/ml，4℃，3h）洗涤2、加杂交瘤培养上清液（）（4℃，1h）3、加辣根过氧化物酶标识羊抗鼠抗体（）（4℃，1h）洗涤洗涤4、加酶作用底物，呈色孔为阳性克隆孔ELISA用于破伤风抗体筛选第40页（2）克隆化——有限稀释法和软琼脂法筛选出来阳性克隆中，也许具有不分泌抗体细胞或有多株分泌抗体细胞，并且刚才融合取得杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，因此应尽早克隆化。第41页一般融合后取得杂交瘤细胞要通过大约3次克隆化，才能达成100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。常用克隆化办法有有限稀释法和软琼脂法。第42页有限稀释法是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只具有一种细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，后来克隆化可用不含HTRPMI1640培养液。由于单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细胞辅助其生长。第43页软琼脂法是在培养液中加入0.5%左右琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块打坏后，移入96孔板中继续培养。用这种办法能够吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，因此用软琼脂法进行克隆化容易成功。第44页四、杂交瘤细胞与抗体性状判定（1）杂交瘤细胞判定正常鼠脾细胞染色体数为40，所有是端着丝粒染色体。杂交瘤细胞染色体在数目上接近两种亲本细胞染色体数目标总和，在构造上除多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。染色体数目较多又比较集中杂交瘤细胞能稳定分泌高效价抗体，而染色体数目少且比较分散杂交瘤细胞分泌抗体能力较低。第45页（2）抗体性状判定可用羊或兔抗Ig不一样类和亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA法来判定。在单克隆抗体判定中还必须进行亲和力测定，它可为正确选择不一样用途单克隆抗体提供根据。另外根据需要不一样，还应对单克隆抗体特异性、纯度和识别抗原相对分子量等进行测定。第46页五、单克隆抗体大量制备（1）体外培养法可取得10g/ml抗体。（2）动物体内诱生法，可取得5-20mg/ml抗体。目前多采取后者生产制备单克隆抗体。由于杂交瘤细胞两种亲本细胞均来自BALB/c小鼠，因此应选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗体。第47页动物体内诱生法操作简便，也比较经济，所得单克隆抗体量较多且效价亦高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌杂交瘤细胞株，缺陷是小鼠腹水中混有来自小鼠多种杂蛋白，给纯化带来难度。第48页六、单克隆抗体纯化1、澄清和沉淀处理小鼠腹水中具有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等，应首先用离心力1000g离心5min，清除残留小颗粒物质；再用0.2m微孔滤膜过滤，除掉污染细菌、支原体和脂质；用饱和硫酸铵沉淀抗体，50%饱和硫酸铵能回收90%以上单克隆抗体。第49页2、分离根据用途可选用不一样办法，主要分离办法有凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析等。（1）凝胶过滤用于IgG和IgM类单克隆抗体分离纯化。常用SephadexG200作分离介质，可搜集到三个峰，最高峰为IgM，另两个峰为IgG，抗体回收率达50%-80%，能清除污染微量杂蛋白，抗体纯度可达95%以上。第50页（2）阴离子交换层析：用于IgG类单克隆抗体分离纯化。在pH7.4条件下，IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上，其中IgG2a可在较低离子强度条件下洗脱下来，其纯度较高。IgG2b、IgG3在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提升产量，但其纯度相对较低。在pH5.5条件下，把杂交瘤细胞培养上清液加到琼脂糖柱上时，所有抗体都能结合到柱上，而55%杂蛋白可被洗脱掉，再用不一样离子强度洗脱剂洗下。第51页

（3）离子交换法在最适离子强度及pH条件下，以离子交换层析分离单克隆抗体能够纯化25-100倍。高容量、高流速、化学稳定新型离子交换剂合适单克隆抗体大规模纯化。第52页（4）亲和层析多用蛋白A亲和层析，适用于IgG类单克隆抗体纯化。IgG与蛋白A结合与pH有密切关系，鼠源性单克隆抗体在pH8.0时，IgG2b、IgG3几乎所有结合于蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5缓冲液可洗脱IgG2b，pH4.0缓冲液可洗脱下IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱下IgG2a，pH6.0可洗脱下IgG1。用蛋白A亲和层析收获抗体纯度很高，但也有极微量杂蛋白。第53页第三节鼠源性单克隆抗体改善改造鼠源性单克隆抗体目标：一是减少免疫原性；二是减少相对分子量，增加组织通透性。第54页如将鼠源性单克隆抗体C区用人Ig分子C区置换，则对人免疫原性消失。对鼠源性抗体改造已有很多成果报道，见书中表4-4，给出了改造后单抗类型和特性。第55页一、人-鼠嵌合抗体制备办法：提取杂交瘤细胞系mRNA，通过逆转录成cDNA，并以其为模板，采取特异引物，用PCR办法分别扩增VL和VH基因，再分别连接真核体现所需上游启动子、前导肽序列和下游剪切供体信号、增强子真核调控序列后，将VL基因克隆到人IgCL基因体现载体上，将VH基因克隆到人IgG1C基因真核体现载体上，再将人-鼠嵌合V-C区基因质粒DNA等量混合，在脂质体介导下共转染骨髓瘤细胞SP2/0，转染后用含霉酚酸进行筛选，形成集落细胞即为共转染细胞，所分泌抗体为嵌合抗体。它保持鼠源性单克隆抗体抗原结合特异性，但对人免疫原性大幅下降了。如若用人IgG1或IgG3C基因替代鼠IgG1或IgG2b，则可有效地加强多肽ADCC效应与免疫调理作用。第56页二、改形抗体假如用鼠源性单克隆抗体CDR序列替代人Ig分子中CDR序列，则可使人Ig分子具有鼠源性单克隆抗体抗原结合特异性。抗体分子中鼠源性部分只占很小百分比，可基本消除免疫原性。这种改形抗体（reshapingantibody）又称CDR移植抗体（CDRgraftingantibody）。书中表4-5给出几个改形抗体及其潜在临床应用。第57页三、小分子抗体基因工程小分子抗体仅体现鼠源性单克隆抗体V区片段，其相对分子量仅为原抗体1/80-1/3。也就是说，保存了CDR区，而Ig分子C区不体现。目前研制小分子抗体有下列几个类型：第58页（1）Fab抗体，由完整轻链和重链（VH和CH1）所组成。（2）FV抗体，由VH和VL组成，天然FV片段中VH和VL为非共价性结合。（3）单链抗体（singlechainantibodySCA或singlechainFV,SCFV），由VH和VL通过一段连接肽（linker）连接而成重组蛋白。有分子量小、穿透力强、免疫原性小特点，可与效应分子相连接构建新功能抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体抱负元件。第59页（4）单域抗体，由VH(VL)单个可变区组成，只有抗体分子1/12，并且表面疏水性强，与抗原非特异结合能力也强。（5）最小识别单位（MRU）是由单个CDR区组成小分子抗体，亲和力较低。第60页四、双功能抗体双功能抗体就是双特异性抗体（biospecificantibody,BsAb）。它是一种非天然性抗体，其结合抗原两个臂具有不一样特异性。1、化学交联法2、生物学办法（杂种-杂交瘤）杂交瘤细胞与脾细胞融合得到可分泌两种亲代抗体和杂种抗体杂种-杂交瘤细胞。第61页3、基因工程办法采取合适接头连接不一样抗体VH和VL区，使它们不能形成链内分子内配对，让其形成原抗体分子内配对，构建双特异性（SCFV)2。第62页五、抗体融合蛋白类型有：（1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fc。（2）配基-Ig嵌合型蛋白，如IL-2-Ig。（3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3。（4）受体