尿素对小鼠遗传毒性的影响

尿素对小鼠遗传毒性的影响

尿素（ure）是根据动物肝脏中的氨含量生成的自然产物。上述不同研究者的遗传毒性研究结果存在矛盾之处，且研究完成时间较早，缺乏近期的研究报道。此外，部分检测方法不够标准化（如噬菌体T4DNA转化试验），并非遗传毒性相关技术指导原则建议的试验方法。本研究使用国际上标准遗传毒性组合中要求的预试验方法，分别开展细菌回复突变试验、基于中国仓鼠肺（ChineseHamsterLung,CHL）细胞的体外染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验，综合评价尿素的遗传毒性风险，为尿素成分在药品、食品、化妆品等领域的应用提供安全性数据。1材料和方法1.1细菌、生物、培养基主要试剂：尿素（NH主要仪器：5810R型离心机（Eppendorf);NTS-1300水浴摇床（EYELA);IS600细菌培养箱（YAMATO);SPECTRAmax-PLUS型酶标仪（MolecularDevices）；二氧化碳培养箱（HERAcellVIOS160i,ThermoFisher）；生物安全柜（NU-543-400S,Nuair）；倒置显微镜（CKX31,Nikon）等。1.2细菌回复突变试验鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型（his底层琼脂、磷酸盐缓冲液、SEM顶层琼脂及S9混合液等配制方法略1.3细胞染色体条数CHL细胞（代数10次以内）购自中国医学科学院细胞库，液氮长期冻存。经鉴定不存在支原体感染，且倍增时间（约14～16h）和核型相符（正常细胞染色体条数23～27条）后用于试验。CHL细胞复苏后，使用RPMI1640培养基（含1%青链霉素混合液和10%胎牛血清）在37℃、5%CO玻片经吉姆萨染色后自然晾干，在显微镜油镜下（40～100×）选择处于中期分裂相且分散良好的细胞进行观察，每一剂量组分析100个中期分裂相细胞。记录染色体结构畸变的畸变类型（包括裂隙、断裂和交换等）和含结构畸变细胞数，以及出现染色体数目畸变（多倍体和内复制）的细胞数。1.4小鼠口服尿素活性试验约6周龄ICR(CD-1）小鼠，SPF级，共70只，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物出售许可证号：SCXK（京）2016-0006]。购入时小鼠体重范围为22～35g，饲养于屏障系统内PC聚碳酸酯鼠盒内。环境温度范围为20～26℃，湿度范围为40%～70%，每小时换气15次以上，照明时间每天12h。提供钴有资料提示大鼠口服尿素的LD试验期间观察动物临床症状及体重变化。取材时摘取双侧股骨，并用胎牛血清冲洗骨髓制备骨髓细胞悬液，手工推片。样本自然晾干后分别经吉姆萨或吖啶橙染色。每只动物计数200个骨髓红细胞中嗜多染红细胞（PolychromaticErythrocytes,PCE）所占比例，并观察计数至少2000个PCE以判断含微核的嗜多染红细胞（MicronucleatedPolychromaticErythrocytes,MNPCE）发生率。1.5染色体畸变试验所有数据均以平均值±标准差表示。细菌回复突变试验中试验组平均每皿中的回复菌落数大于或等于溶媒对照组数值3倍，且存在量效关系时判断结果为阳性；反之为阴性；染色体畸变试验中各组结构畸变率及数据畸变率差异使用卡方检验比较；骨髓微核试验采用“Poisson分布两样本均数比较”方法比较给药组的微核率与溶媒对照组的差异是否存在统计学意义上的显著性。当P<0.05时，认为存在显著性差异。2结果2.1细菌回复突变试验细菌回复突变试验结果如表1所示。有和无S9代谢活化条件下，尿素浓度为185～5000μg/皿时，对各测试菌均无抑菌作用，且未见沉淀产生，各菌回复突变菌落数与阴性对照组比较均未见明显增加。因此，本研究中尿素对测试菌株无致突变作用。2.2chl细胞结构畸变试验结果染色体畸变试验结果详见表2～表4。非代谢活化条件下，分别与0.63mg/mL、1.25mg/mL和2.50mg/mL尿素作用6h后CHL细胞结构畸变率分别为2.0%、2.0%和3.0%；数目畸变率分别为3.0%、4.0%和4.0%。与0.16mg/mL、0.32mg/mL、0.63mg/mL尿素持续作用24h后CHL细胞结构畸变率分别为1.0%、1.0%和3.0%；数目畸变率分别为2.0%、1.0%和3.0%。代谢活化条件下，与0.32mg/mL、0.63mg/mL、1.25mg/mL尿素作用6h后CHL细胞结构畸变率分别为2.0%、2.0%和1.0%；数目畸变率分别为2.0%、2.0%和3.0%。所有条件下结构畸变类型均以裂隙为主，其次为断裂，偶见交换；数目畸变类型均为多倍体增加。经统计学分析，尿素导致的结构畸变率和数目畸变率与阴性对照组比较均无显著性差异（P>0.05）。2.3小鼠骨髓微核试验试验期间阴性对照组、阳性对照组及所有给药组动物未见动物死亡、濒死，均无异常临床症状，且各剂量组动物的平均体重与同性别相同时间段对照组比较均未见显著性差异，提示单次经口灌胃10000mg/kg及以下剂量尿素对ICR小鼠体重无明显影响。给予尿素后24h,2500mg/kg剂量组、5000mg/kg剂量组、10000mg/kg剂量组和阳性对照组动物的嗜多染红细胞/红细胞（PCE/ERY）的平均比值与溶媒对照组相比分别为118%、105%、100%和111%；平均含微核的嗜多染红细胞率分别为0.170%±0.162%、0.190%±0.223%和0.370%±0.079%（表5），与同时期阴性对照组（0.100%±0.085%）比较无显著性差异（P<0.05）。给予尿素后48h取小鼠骨髓，10000mg/kg剂量组动物PCE/ERY的平均比值与溶媒对照组相比为99%；平均含微核的嗜多染红细胞率为0.230%±0.165%（表3），与同时期阴性对照组（0.080%±0.059%）比较无显著性差异（P>0.05）。上述结果提示单次经口灌胃给予ICR小鼠高达10000mg/kg的尿素对动物骨髓红细胞增殖无明显抑制作用，且未见对骨髓嗜多染红细胞微核发生率产生影响。3整体遗传毒性评价结果本研究开展了尿素的细菌回复突变试验、哺乳动物细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验，评价尿素潜在遗传毒性风险。结果发现，尿素浓度为5000μg/皿及以下时无诱导细菌碱基突变作用，在无明显细胞毒性（-S9条件2.50mg/mL及以下浓度作用6h或0.63mg/mL及以下浓度作用24h;+S9条件1.25mg/