大鼠肝癌发生过程中bFGF的表达及意义

大鼠肝癌发生过程中bFGF的表达及意义作者；白咸勇，贾秀红，刘同慎，李笑岩【摘要】目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)在肝癌发生过程中的表达及意义。方法采用免疫组织化学ABC法对二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌发生过程中碱性成纤维细胞生长因子表达情况进行观察。结果DEN诱发大鼠肝癌发生率为100%。正常大鼠肝细胞bFGF表达为阴性，于诱癌第8周，肝小叶近门管区血管附近的少量肝细胞呈bFGF阳性表达，并可见门管区血管内皮细胞和成纤维细胞也呈bFGF阳性表达，随着诱癌进程的发展，bFGF阳性肝细胞的数量逐渐增多，至诱癌第18周，癌结节内大部分肝癌细胞均呈bFGF阳性表达。结论bFGF与肝癌的发生和发展具有相关性。【关键词】bFGF；大鼠；肝癌发生；免疫组织化学Theexpressionandsignificanceofbasicfibroblastgrowthfactor(bfGF)duringhepatocarcinogenesisintherats[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheexpressionandsignificanceofbasophilicfibroblastgrowthfactorduringhepatocarcinigenesisintherats.MethodsHepatomawasinducedintheratsbyadministrationofdiethylnitrosamine(DEN)，theexpressionofbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)wasdetectedwithimmunohistochemicaltechnique.ResultsTheincidenceofhepatocarcinogenesisinducedbyDENwas100%，theexpressionofbFGFwasnotdetectedinhepatocytesofnormalrats，afewofbFGFpositivehepatocytesweredetectednearthefibrousseptumsbetweenhepaticlobulesat8thweekafterDENtreatment，andthepositiveexpressionofbFGFwasalsodetectedintheendothelialcellsofbloodvesselsandthefibroblast，thenumberofbFGFpositivehepatocytesincreasedalongwiththeprocessofcarcinogenesis，themajorityofhepatocytesofbasophilicnodulesexpressedbFGFat18thweekafterDENadministration.ConclusionbFGFisassociatedcloselywiththedevelopmentandprogressionofhepaticcarcinoma.[Keywords]bFGF;rat;hepatocarcinogenesis;immunohistochemistry恶性肿瘤的发生、发展、浸润及转移均依赖于肿瘤新生血管的生成［1］。在肿瘤血管生成过程中，促血管生长因子扮演着重要角色，其中碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)更为引人关注［2］。肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，具有高侵袭、易于早期转移、预后差的临床病理特征。但有关bFGF在肝癌发生发展过程中的表达及意义的报道较少。为了解bFGF在肝癌发生发展过程的表达及意义，探讨其与肝癌生物学行为的关系。本实验采用免疫组织化学方法，对二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌过程中bFGF表达的变化进行了观察，以便为肝癌发生和防治研究提供实验依据。1材料与方法1.1肝癌动物模型的建立和病理学检查雄性Wistar大鼠(由中国科学院上海实验动物中心提供)30只，体重100〜150g，动物随机分为两组，实验组15只，饲以含二乙基亚硝胺(80ppm/ml)饮水，连续12周；对照组15只，自由饮取自来水。各组动物自诱癌之日起，分别在第4、8、12、16、18周各随机选择3只大鼠断头处死，取肝组织，中性福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，厚5um，HE染色，光镜观察。1.2bFGF免疫组织化学染色采用ABC法，兔抗人bFGF多克隆抗体购自Sigma公司，免疫组织化学ABC试剂盒购自美国Vector公司。主要反应步骤如下：(1)切片脱蜡至水；(2)3%H2O2甲醇30min；(3)1：5正常羊血清孵育30min；(4)兔抗人bFGF多克隆抗体(1：500)，4°C孵育过夜；(5)生物素化羊抗兔IgG(1：200)孵育30min；(6)ABC液(1：1：100)孵育30min；(7)DAB显色，水洗后常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，以PBS代替一抗作为阴性对照。2结果2.1诱癌过程中大鼠肝脏的病理变化第1〜4周诱癌大鼠肝脏肉眼观察未见明显异常，镜检肝小叶结构完整，但可见散在的坏死灶伴炎性细胞浸润，并且肝细胞发生嗜酸性变。第8〜12周诱癌大鼠肝脏体积逐渐增大，表面可见散在的灰白结节，并逐渐增多，镜检可见肝脏内出现大量嗜酸性结节，并向嗜碱性结节发展。第18周，肝脏表面布满灰白色结节，镜检为高分化肝细胞癌，门管区静脉内可见癌栓形成，个别大鼠肺内可见肝细胞癌转移灶，细胞形态和原发灶相似，可见病理性分裂相。2.2诱癌过程中肝脏bFGF的表达正常大鼠肝细胞bFGF表达为阴性，于诱癌第8周，肝小叶近门管区血管附近的少量肝细胞呈bFGF阳性表达，并可见门管区血管内皮细胞和成纤维细胞也呈bFGF阳性表达(图1)，随着诱癌进程的发展，bFGF阳性肝细胞的数量逐渐增多。至诱癌第18周，癌结节内大部分肝癌细胞均呈bFGF阳性表达(图2),bFGF免疫反应阳性产物为胞浆内棕褐色颗粒，但同一癌结节内的不同肝癌细胞bFGF的反应强度不一致，同只大鼠不同癌结节内bFGF的阳性肝癌细胞的数量和反应强度也有较大差别。3讨论碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)是成纤维生长因子家族中的一员，最初由Gospodarowiz于1974年从牛脑垂体中提取的一种对3T3成纤维细胞有明显促增值作用的多肽因子°bFGF在体内分布广泛，存在来源于中胚层及神经外胚层的细胞及多种肿瘤细胞中，通过细胞膜上的特异的高亲和力受体(FGFR)，参与胚胎发育、血管生成、损伤修复、神经再生、肿瘤生长等生理及病理过程】3］。研究表明，bFGF作为一种细胞丝裂原和促血管生长因子，在肿瘤的生长过程中发挥着重要作用。许多肿瘤细胞存在FGFR的高表达，通常比正常细胞高10倍以上，有的肿瘤细胞(神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、肝癌等)既表达bFGF又表达FGFR，bFGF可通过自分泌和旁分泌作用直接刺激肿瘤细胞。Kim发现bFGF能刺激肝癌细胞DNA合成，并提高其转移能力［4］。Ogasawara发现6个人肝癌细胞株均表达bFGF和FGFR，将抗bFGF抗体加入培养基中，可明显抑制肝癌细胞的增殖，而加入bFGF则促进肝癌细胞增殖，从正反两方面证明了bFGF对肿瘤细胞的促增殖作用［5］。目前认为，除了bFGF对肿瘤细胞的促增殖作用，其促肿瘤血管生成作用在肿瘤的发生发展中亦起重要作用，并可能是bFGF参与肿瘤病理过程的主要途径。人结肠癌DLD细胞系不表达FGFR，在体外实验中对加入的重组人bFGF无反应，但在植入DLD细胞的裸鼠模型中，注入重组bFGF，结果与对照组相比，不仅肿瘤体积增大，而且浸润到腹膜腔。这提示bFGF在此模型中的作用途径主要是通过促肿瘤血管生成［6］。本实验结果发现，正常大鼠肝细胞bFGF表达为阴性，自DEN诱癌第8周，肝小叶近门管区血管附近的少量肝细胞呈bFGF阳性表达，并可见门管区血管内皮细胞和成纤维细胞也呈bFGF阳性表达，随着诱癌进程的发展，bFGF阳性肝细胞的数量逐渐增多。至诱癌第18周，癌结节内大部分肝癌细胞均呈bFGF阳性表达，其中的成纤维细胞和血管内皮细胞也表达bFGF。从而推测bFGF很可能以自分泌及旁分泌机制促进肝癌的发生和发展，bFGF表达可能不是肝癌发生中的早期事件，肝癌细胞bFGF表达强度不一，可能与细胞分化程度有关［7］。本研究发现，在诱癌过程中，门管区静脉内可见癌栓形成，个别大鼠肺内可见肝细胞癌转移灶。有研究报道，bFGF阳性肿瘤预后较差，可能与bFGF提高胶原酶活性和纤维蛋白溶酶原激活因子，使肿瘤细胞易于侵入周围组织有关［8］。从而推测肝癌细胞产生的bFGF可能有多方面的作用，它可提高肝癌细胞分泌的蛋白水解酶的活性，使肝癌细胞侵入周围组织，还可通过旁分泌方式刺激血管内皮细胞分裂增殖，使肝癌组织血管化加快并发生转移［8］。肝癌发生常伴有肝纤维化和肝硬化，这也提示bFGF在肝癌发生和发展中起一定的作用［9］。总之，关于bFGF在肝癌发生发展中的作用及机制还有待于进一步研究，以便为肝癌的临床诊断与治疗提供实验依据。FolkmanJ.Whatistheevidencethattumorsareangiogenesisdependent.JNatCancerInst，1990，82(1):4-6.DirixLY，VermeulenPB，PawinskiA，etal.Elevatedlevelsoftheangiogeniccytokinesbasicfibroblastgrowthfactorandvascularendothelialgrowthfactorinseraofcancerpatients.Br，1997，76(2):238-267.OkadaBanM，ThieryJP，JouanneauJ.Fobroblastgrowthfactor-2.IntJBiochem，2000，32(3):263-243.KimM，SataM，Ueno，etal.Basicfibroblastgrowthfactorregulatesproliferationandmotilityofhumanhepatomacellsbyaautocrinemechanism.JHepatol，1997，27(4):677-687.OgasawaraS，YanoH，IemuraA，etal.Expressionofbasicfibroblastgrowthfactoranditsreceptorsandtheirrelationshiptoproliferationofhumanhepatocellularcarcinomacelllines.Hepatology，1996，24(1):198-205.6秦艳芳，向军剑，杨红宇.碱性成纤维细胞生长因子与肿瘤.国外医学肿瘤学分册，2001，28(4):256-259.YoshiharuM，SawabuN，NakanumaY.Expressionofepidermalgrowthfactorandfibroblastgrowthfactorinhumanhepatocellularcarcinoma.AnImmunohistochemicalStudy.Liver，1991，11(1):272-278.TakanamiI，TanakaF，HashizumeT，