流感病毒的分离培养专家讲座

一、流感病毒MDCK细胞分离方法（一）生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒MDCK细胞分离试验室生物安全级别：BSL-3。试验操作人员需进行BSL-3防护，详细详见“生物安全个人防护SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级试验室生物安全柜中进行。流感病毒的分离培养专家讲座第1页其余流感病毒MDCK细胞分离试验室生物安全级别：BSL-2。试验操作人员需进行BSL-2防护，详细详见“生物安全个人防护SOP”。其余流感病毒MDCK细胞分离操作必须在BSL-2级试验室生物安全柜中进行。流感病毒的分离培养专家讲座第2页（二）材料1、75％～90％成片MDCK细胞，选取适当大小细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离2、胰酶（牛胰腺起源Ⅷ型）3、HEPES缓冲液，1M母液4、D-MEM培养基，Hank's液5、青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素流感病毒的分离培养专家讲座第3页6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液7、临床样品0.5mL8、1mL无菌移液管9、10mL无菌移液管10、15mL无菌离心管流感病毒的分离培养专家讲座第4页（三）试验步骤1、准备病毒生长液（1）细胞维持液准备500mLD-MEM液中加入①青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）②牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）③HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）流感病毒的分离培养专家讲座第5页（2）病毒生长液每500mL细胞维持液中加入0.5mLTPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶终浓度为2µg/mL。2．流感病毒MDCK细胞分离步骤：（1）75％～90％成片细胞准备，以选取T25细胞瓶为例。①用40×物镜观察细胞生长状态。②轻轻倒出细胞生长液，用10mL无菌移液管吸收6mLHank's液分别清洗细胞3遍。流感病毒的分离培养专家讲座第6页（2）细胞培养瓶接种①用无菌移液管将清洗细胞Hank's液从细胞培养瓶中移出。②用无菌移液管吸收适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。③然后放于37℃，5%CO2培养箱中吸附1～2h。④吸出接种物，用10mL无菌移液管吸收6mLHank's液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。⑤放置于33～35℃培养箱培养。⑥每日观察细胞病变情况。（细胞病变特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。

流感病毒的分离培养专家讲座第7页（3）细胞培养物收获当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前能够将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提升收获标本病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL无菌移液管吸收病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获病毒液能够马上进行后续试验，或冻于-80℃冰箱待以后试验使用。流感病毒的分离培养专家讲座第8页二、流感病毒分离之鸡胚培养法

（一）、检视标识鸡胚（1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态血管：活胚血管清楚；死胚含糊，成淤血带或淤血块胎动：活胚有显著自然运动，死胚无胎动绒毛尿囊膜发育界限：密布血管绒毛尿囊膜与鸡胚胎另一面形成显著界限（2）标识出鸡胚气室与尿囊界限（3）假如鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉流感病毒的分离培养专家讲座第9页（二）、接种样本将标识好鸡胚气室朝上放置在照蛋器上。（2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。(3)用注射器吸800µl标本。(4)从窗口中滴入无菌液体石蜡，轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即可清楚看到鸡胚胎位置。将注射针头刺入胚胎鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚伴随针头拨动而动，即可注射200µl标本。将针头退出至½寸，将另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2个鸡胚。流感病毒的分离培养专家讲座第10页(5)将针头弃于适当生物安全装置中(6)用消毒过医用胶布封口(7)33～35oC温箱培养鸡胚2～3天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天。注意：鸡胚进行病毒分离培养时，天天检验鸡胚生长情况，24小时内死亡鸡胚，认为是非特异死亡应弃去流感病毒的分离培养专家讲座第11页+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但还有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。

“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集红细胞在管底中心聚成小圆