凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座

凝胶层析法分离纯化蛋白质

凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第1页【目标】掌握凝胶层析基本原理学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质试验技能凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第2页

【原理】

凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用含有网状结构凝胶分子筛作用，依据被分离物质分子大小不一样来进行分离技术。凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第3页

凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象“筛子”。不一样类型凝胶筛孔大小不一样。凝胶过滤层析凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第4页带网孔葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第5页凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第6页总结：相对分子质量较大物质因为直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外空间向下流动，所以流程较短，移动速度快；所以首先流出。相对分子质量较小物质因为直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒网孔，在向下移动过程中，所以流程较长，移动速率慢；所以最终流出。中等大小分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透程度取决于它们分子大小，所以它们流出时间介于二者之间，这么分子大组分先流出，分子小组分后流出。这么样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小次序依次流出，从而到达了分离目标。凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第7页【试验器材】层析柱恒流泵紫外检测仪部分搜集器试管等普通玻璃器皿凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第8页凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第9页凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第10页凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第11页凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第12页【试验试剂】待分离样品葡聚糖凝胶SephadexG-100洗脱液：0.1mol/LpH6.8磷酸缓冲液凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第13页【操作方法】一、凝胶处理

SephadexG-100干粉经蒸馏水室温充分溶胀48h，或沸水浴中煮沸2h，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中空气。

凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第14页二、装柱

关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高，将浓浆状凝胶迟缓地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降约1㎝高度后打开出水口，继续加入凝胶浆，直到凝胶沉积至一定高度即可。装柱要求连续，均与，无气泡，无“纹路”。凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第15页三、平衡将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2～3倍柱床体积洗脱液平衡，流速为0.5ml/min。凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第16页四、加样与洗脱将柱中多出液体放掉出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，加洗脱液至液层4cm左右，接上恒流泵，开始洗脱（0.5ml/min）。凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第17页五、搜集与测定用部分搜集器搜集洗脱液。紫外检测仪280nm处检测，将检测信号输入色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第18页六、凝胶柱处理凝胶用过后，重复用蒸馏水经过柱（2~3倍床体积）即可。凝胶层析法分离纯化蛋白质专家讲座第19页注意事项各接头不能漏气，连续用小乳胶管不要有破损，不然造成漏气、漏液。注意恒压瓶内排气管应无液体，并伴随柱下口溶液流出不停有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不停下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检验并加以纠正。一直保持柱内