基于传统培养和宏基因组测序法解析小龙虾携带污染菌的差异

基于传统培养和宏基因组测序法解析小龙虾携带污染菌的差异

克氏原始锚通常位于北美。传统培养基分离鉴定法是利用各类具有选择性的固体培养基对样品处理液中的细菌进行计数、分离，而后提取、扩增DNA，通过NCBIBlast分析DNA序列，确定菌株类别小龙虾好温喜湿，不同产地的地理条件、养殖环境与饲料不尽相同，因此在研究其所携带菌群时，需结合多个因素综合考虑1材料和方法1.1培养基和试剂小龙虾来源于浦口、太湖东山，冷鲜包装后由顺丰快递寄至实验室备用。PCA菌落计数培养基、BHI脑心浸液肉汤、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）、甘露醇氯化钠琼脂（MSA）、乳酸菌琼脂基础培养基（MRS）、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、营养肉汤（NB）、脑心浸出液肉汤（BHI），北京奥博星生物技术有限公司；假单胞菌琼脂基础培养基（CN琼脂），山东青岛海博生物技术有限公司。1.2治疗非织造材料M124A电子分析天平，意大利BEL公司；SW-CJ-1FD型无菌操作台，苏州净化设备有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Centrifuge5810R离心机、Centrifuge5424R离心机，德国Eppendorf公司；UnicenMR台式冷冻离心机，德国Herolab公司；Direct-Q3纯水/超纯水一体化系统，默克化工技术（上海）有限公司。1.3表面样品的制备对两产地小龙虾分别进行3种处理：(1)称取50g鲜活小龙虾，均质后随机取10g加入90mL生理盐水得到小龙虾整体样品；(2)随机挑选10只大小均等的小龙虾，加入225mL生理盐水得到小龙虾表面样品；(3)无菌条件下取出虾尾肉，取10g剪碎后加入90mL生理盐水得到小龙虾尾肉（带肠）样品。每组样品设置3个平行，分别均质30min。1.4减少细菌数量和优势腐败菌的保护采用GB4789.2-20161.5离心10min，回收沉淀将1.3节中的样品均质液在4℃，2000r/min条件下离心10min，取上清。在4℃，12000r/min条件下离心10min，弃上清，收集沉淀。质检DNA，将合格样品置于-80℃保存。1.6微生物将在-80℃冰箱中冻存的DNA样品置于干冰中，送至奥维森有限公司测序，使用IlluminaMiseqPE300高通量测序平台。在细菌16SrD-NAV3-V4区进行菌群检测，利用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）及806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）对样品进行扩增1.7数据分析方差分析使用SPSS16.0软件，获得显著性分析。所有试验重复3次。2试验结果2.1菌落总数分析图1为3个产地小龙虾初始菌落数。由图1a可知，浦口小龙虾整体样品和太湖东山小龙虾整体样品的菌落总数相近，分别为7.78lg(CFU/g）和7.76lg(CFU/g）。浦口、太湖东山地区的小龙虾表面所含菌落数为6.49,7.37lg(CFU/g）（图1b）。从图1c可知，浦口小龙虾尾肉的菌落数为7.26lg(CFU/g），太湖东山地区所产小龙虾尾肉菌落数为7.46lg(CFU/g）。两地小龙虾各部位初始菌落数的差异可能与产地的地理条件和养殖环境有关2.2srrna扩增产物对特征菌落进行平板划线，分离得115株菌。采用琼脂糖凝胶电泳检测16SrRNA扩增产物。成功扩增的样品在1500bp处出现明显特异性条带，分析条带对应的菌株序列，进行NCBIBlast分析，取同源性大于98%的序列信息，确定种属2.3地小龙虾不同部位菌群的序列信息用FLASH软件及Trimmomatic优化IlluminaMiseq宏基因组测序法获取两产地小龙虾不同部位样品菌群的序列信息，18个小龙虾样品共得到1480950条有效序列，序列长度多在200～260bp之间（图2a）。由图2b可看出，随着样品量的增加，当序列量在20000条以上时，曲线逐渐平坦，说明测序数据量充足，具有合理性，足够体现研究对象的菌群多样性信息。2.4不同部位微生物群落水平Alpha多样性指数（包括Chao1、PD＿whole＿tree、observed＿species及Shannon指数）分析可以反馈小龙虾各部位微生物群落的丰度和均匀度。Chao1及observed＿species指数能体现菌群丰度（Speciesrichness）。Shannon指数可体现符合本研究主题的菌群多样性（Speciesdiversity),PD＿whole＿tree指数可以体现小龙虾各部位所含微生物对进化历史的留存差别2.5物种组成和聚类分析获取各OTU对应物种分类信息后，在科、属水平上标注不同样品的微生物菌属信息。2.5.1不同产地小龙虾主要优势菌群特性由图4可知，两产地小龙虾的初始菌相主要由肠杆菌科、莫拉氏菌科、Family＿XII、黄杆菌科和气单胞菌科5大菌群组成，每个菌群的相对丰度不低于20%。两产地小龙虾各样品菌相虽有共性，但差异也十分明显。肠杆菌科作为优势菌群存在于两产地小龙虾整体，而Family＿XII、黄杆菌科分别是浦口、太湖东山小龙虾整体的优势菌群。莫拉氏菌科是两地小龙虾表面样品中共同的优势菌群，与整体样品一致。Family＿XII、黄杆菌科也分别是浦口、太湖东山小龙虾表面的优势菌群。肠杆菌科和气单胞菌科是两地小龙虾尾肉的主要携带菌群，而太湖东山小龙虾尾肉中气单胞菌科的相对丰度比浦口小龙虾尾肉样品高。除此之外，所有样品中均存在一些丰度高于5%的菌科，如希瓦氏菌属希瓦氏菌科、拟杆菌科、支原体科、动性球菌科和假单胞菌科。2.5.2异大地尾肉体内微生物菌种从图5可以发现，各样品微生物多样性丰富，丰度较高的有黄杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、耶尔森氏鼠疫杆菌属、嗜冷杆菌属、希瓦氏菌属、拟杆菌属、稳杆菌属等，两产地样品菌相类似，而菌群丰度差异大，其中浦口小龙虾整体携带菌为微小杆菌属微小杆菌属、金黄杆菌属、不动杆菌属和黄杆菌属。太湖东山小龙虾整体携带菌主要有黄杆菌属、气单胞菌属、希瓦氏菌属和不动杆菌属。浦口小龙虾表面携有不动杆菌属、微小杆菌属、金黄杆菌属和嗜冷杆菌属。太湖东山表面携带黄杆菌属、气单胞菌属、不动杆菌属和假单胞菌属。浦口小龙虾尾肉主要携带菌为希瓦氏菌属、拟杆菌属、耶尔森氏鼠疫杆菌属和气单胞菌属。太湖东山小龙虾尾肉含有的微生物有希瓦氏菌属、气单胞菌属、耶尔森氏鼠疫杆菌属及拟杆菌属。两产地小尾肉部位都检出耶尔森氏鼠疫杆菌属，且相对丰度较高。耶尔森氏菌分布较广，容易导致感染对象罹患急性肠胃炎，1岁以下的婴幼儿较易感染2.6细菌多样性分析热图可以通过色彩的渐变差异反映表格中最原始的数据信息或二维矩阵，聚合18个样品的多样性数据，颜色深浅简洁地展示数据梯度，结果见图6。图中的不同样品根据污染菌丰度的差异进行了聚类，两产地小龙虾样品携带的菌群：不动杆菌属、金黄杆菌属和气单胞菌属等在样品中的比例大致相同。浦口样品中嗜冷杆菌属、微小杆菌属和耶尔森氏鼠疫杆菌属的丰度较太湖东山地区样品高，而太湖东山样品中希瓦氏菌属和假单胞菌属的相对丰度比浦口地区样品高。2.7两地中小企业菌群组成比较由图7可知，第1主成分（横轴PC1）与第2主成分（横轴PC2）的贡献率分别为43.15%和35.6%。图中各部位代表点的距离越近，该部位菌群组成相似度越高。两产地小龙虾尾肉样品与小龙虾整体、表面这2个部位的距离远。两产地小龙虾的表面与整体部位距离近，说明养殖环境（主要是水体环境）对小龙虾整体携带的菌群多样性影响程度高。3微生物菌群组成以不同产地的小龙虾为研究对象，运用IlluminaMiseq宏基因组测序法探究生鲜小龙虾3个部位样品的菌相构成。采用传统培养法分离所得污染菌为气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、蜂房哈夫尼菌和克雷伯氏菌属。宏基因组测序显示，两产地小龙虾所携带菌群组成存在差异：浦口新鲜小龙虾样品中的微生物主要有不动杆菌属、气单胞菌属、微小杆菌属、假单胞