基因工程综合实验

基因工程综合实验基因工程综合实验第1页异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）基因工程综合实验第2页SDS电泳:

不一样蛋白质分子含有不一样电荷和分子量。蛋白质在强阴离子去污剂SDS与某一还原剂(如二巯基乙醇)共同作用下并加热使蛋白质解离后，变性蛋白质与SDS结合并所以而带负电荷，不一样蛋白质结合SDS量仅与分子量成正比而与氨基酸序列无关，在SDS电泳时，蛋白质在聚丙烯酰胺中迁移率仅仅取决于蛋白质分子量。聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联剂N，N′—亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成三维网状结构。凝胶电泳不但含有分辨不一样分子量蛋白质作用(即分子筛作用)，还含有浓缩作用。因为不连续缓冲系统含有把样品中SDS-多肽复合物全部浓缩于极小体积能力，从而提升了分辨率。采取考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。基因工程综合实验第3页大肠杆菌高效表示外源基因须遵照基础标准

大肠杆菌表示系统是当前应用最广泛表示系统，因为待表示外源基因结构含有多样性，尤其是真核生物基因结构与大肠杆菌基因结构之间存在较大差异，因而在构建表示系统时必须详细情况详细分析。普通来说，高效表示外源基因必须考虑以下基础标准。基因工程综合实验第4页1、优化表示载体设计

为了提升外源基因表示效率，在构建表示载体时，对决定转录起始开启子和决定mRNA翻译SD序列进行优化。详细方法包含组合强开启子和强终止子；增加SD序列中与核糖体16SrRNA互补配正确碱基因序列，使SD序列中6～8个碱基与核糖体16SrRNA碱基完全配对；依据待表示外源基因不一样情况调整SD序列与起始密码子ATG之间距离及碱基种类；预防核糖体结合位点附近序列转录后形成“茎环”二级结构。Shine-Dalgarnosequence;SDsequence因澳大利亚学者夏因(Shine)和达尔加诺(Dalgarno)两人发觉该序列功效而得名。信使核糖核酸(mRNA)翻译起点上游与原核16S核糖体RNA或真核18SrRNA3′端富含嘧啶7核苷酸序列互补富含嘌呤3～7个核苷酸序列(AGGAGG)，是核糖体小亚基与mRNA结合并形成正确前起始复合体一段序列。基因工程综合实验第5页2、提升稀有密码子tRNA表示作用。

数密码子含有简并性，而不一样基因使用密码子频率不相同。大肠杆菌基因对一些密码子使用表现了较大偏爱性，在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁地使用。如编码Pro密码子包含CCG、CCC、CCU和CCA等。第一个密码子在大肠杆菌基因中都高频地出现，而另外三个密码子出现频率很低。此时可经过点突变等方法将外源基因中稀有密码子转换为在受体细胞中高频出现同义密码子。同义密码子使用频率与细胞内对应tRNA丰度呈正相关，稀有密码子tRNA在细胞内丰度很低。在mRNA翻译过程中，往往会因为外源基因中含有过多稀有密码子而使细胞内稀有密码子tRNA供不应求，最终使翻译过程终止或发生移码突变。基因工程综合实验第6页3、提升外源基因mRNA稳定性。

大肠杆菌核酸酶系统能专一性地识别外源DNA或RNA并对其进行降解。对于mRNA来说，为了保持其在宿主细胞内稳定性，可采取两种办法，一是尽可能降低核酸外切酶可能对外源基因mRNA降解，二是改变外源基因mRNA结构，使之不易被降解。基因工程综合实验第7页4、提升外源基因表示产物稳定性

大肠杆菌中含有各种蛋白水解酶，在外源基因表示产物诱导下，蛋白水解酶活性可能会增加。所以，须采取各种办法提升外源蛋白在大肠杆菌细胞内稳定性。常见方法包含：①将外源基因表示产物转运到细胞质或培养基中；②选取一些蛋白水解酶缺点株作为受体菌；③对外源蛋白中水解酶敏感序列进行修饰或改造；④在表示外源蛋白同时，表示外源蛋白稳定因子。基因工程综合实验第8页5、优化培养与诱导过程

优化培养过程包含多方面，首先是与细菌生长亲密相关条件或原因，如培养系统中溶氧（转速）、pH值、温度和培养基成份等，这些条件改变都会影响细菌生长及基因表示产物稳定性。第二方面是对外源基因表示条件优化。细菌生长到一定阶段后，开始诱导外源基因表示，诱导方式包含添加特异性诱导物和改变培养温度等。基因工程综合实验第9页试验用材料、器皿及试剂1、材料菌株和质粒：BL21(pETTEVCP)

垂直电泳装置2、试剂

—IPTG贮备液：

—l×凝胶电泳加样缓冲液：

—30%Acr-0.8%Bis（W/V）

—TEMED:直接用原液，防止挥发。

—电极缓冲液（pH8.3）

—2×样品稀释液

—染色液

—脱色液

基因工程综合实验第10页pET-22b（+）质粒图谱TEV-CPBamHIEcoRI基因工程综合实验第11页基因工程综合实验第12页

1、蛋白质诱导表示（1）将含有外源基因单菌落加入到10ml含有AmpLB培养基中，37℃220rmp过夜培养（14-16小时）。（2）取300μl培养液于10ml无抗生素LB培养基（1:100），37℃220rmp培养45分钟，至菌液OD600≌0.4-1.0（最好0.6），加入40μlIPTG至终浓度为1mmol/L，继续诱导培养2-3小时。（3）取上述菌液1ml于离心管中，并以未诱导空白载体细菌培养物为对照，冰上放置5分钟，离心（6000rmp）1

分钟。（4）在沉淀中加入100μl1×凝胶加样缓冲液，沸水中加热5

分钟。离心（1rmp）1分钟，（5）取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。试验操作程序基因工程综合实验第13页2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）制备分离胶按下表配制分离胶。

6.255.63.10.18750.12512.530%Acr-0.8%Bis（mL）1mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液（mL）H2O（mL）10%SDS（mL）10%过硫酸铵（mL）TEMED（uL）用量试剂将上述胶液配好，混合后，快速注入两块玻璃板间隙中，至胶液面离玻璃凹槽3.5cm左右。然后在胶面上轻轻铺1cm高水，加水时通常顺玻璃板慢慢加入，勿扰乱胶面。垂直放置胶板于室温约20-30min左右使之凝聚，此时，在凝胶和水之间能够看到很清楚一条界面，然后析出胶面上水。基因工程综合实验第14页（2）制备浓缩胶

制备方法按下表相对百分比混合所需溶液，用少许灌入玻璃板间隙中，冲洗分离胶胶面，然后倒出。把余下倒入玻璃板间隙中，使液面与玻璃板凹槽处齐平，插入梳子，室温放置20-30min。凝聚后小心拔出梳子。取出梳子后向形成胶孔加入蒸馏水，冲洗出未凝聚丙烯酰胺等，倒出孔中水，再加入电极缓冲液。1.671.257.030.10.110.030%Acr-0.8%Bis（mL）1mol/LpH6.8Tris-HCl（mL）H2O（mL）10%SDS（mL）10%过硫酸铵（mL）TEMED（μL）用量试剂基因工程综合实验第15页（3）将灌好胶玻璃板垂直固定在电泳槽上，带凹槽玻璃板与电泳槽紧贴在一起，形成一个贮液槽，向其中加入电极缓冲液液，使其与胶孔中缓冲液相接触。在电泳槽下端贮液槽中也加入电极缓冲液。（4）加样：加样量应适中，样品中最少含有0.25μg蛋白质，染色后才能检测得出，1.0μg蛋白质则十分显著。样品点样体积依据样品溶液浓度和凝胶孔大小，可在20μL。加样时用微量进样器（50-100μL体积）吸收已处理好标准蛋白质样品20μL（或依据商品说明加样）。

1X凝胶电泳加样缓冲液：

50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS0.1%溴酚蓝

10%甘油基因工程综合实验第16页（5）电泳及结果测量将电泳槽及电泳仪相连接，上槽为负极，下槽为正极。打开电源开关，将电压调到最大，调整电流旋钮，使每板电流为25mA进行电泳，直至样品中染料迁移至下端1cm时，停顿电泳。取下玻璃板，小心地把其中一块玻璃板从凝胶上取下来。基因工程综合实验第17页3、染色和脱色

将分离胶个别取下，放在盛有染色液染色槽中浸泡30min左右。倒去染色液，用蒸馏水漂洗一次，然后加入脱色液，室温浸泡凝胶或者放在摇床上振动脱色，更换几次洗脱液，直至蛋白质区带清楚。97664429M123kDa图8TRSV-CPSDS电泳

1，3：诱导处理菌液；

2：未诱导菌液；

M：蛋白质分子量基因工程综合实验第18页思索题1、简述SDS原理及测定方法。2、诱导外源基因在大肠杆菌中表示方法有哪些？加入IPTG作用是什么？(作业)3、在聚丙烯酰胺中为何蛋白质迁移率仅仅取决于其分子量？4、聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶由哪几个别组成？（作业）5、大肠杆菌高效表示外源基因必须遵照基础标准？基因工程综合实验第19页试验八农杆菌介导烟草基因转化原理：农杆菌发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和琥珀碱型甘露碱型、黄瓜碱型和农杆碱型冠瘿碱基因工程综合实验第20页LB(25bp)RB(25bp)T-DNA(23kb)

图4-12Ti质粒结构示意图

Vir区基因(30-40kb)Ti200kbT-DNA转化需要Vir区基因表示和左右边界（LB、RB）存在基因工程综合实验第21页Ti质粒作为基因转化载体形式：共整合载体同源序列LBRBKm

rKmR目标基因同源序列同源序列vir区基因工程综合实验第22页双元载体助手Ti质粒pAL4404LBRB多克隆位点植物选择基因细菌选择基因lacRK2orivir区基因工程综合实验第23页将双元载体转入农杆菌两种方法细胞内含有携带Vir区基因质粒，常见菌株有LBA4404、EHA105三亲交配法冻融法将提取双元载体与含Ti质粒农杆菌混合，在液氮中速冻1分钟，然后在37℃下融化。基因工程综合实验第24页

影响农杆菌介导基因转化效率原因：1、菌株染色体背景

不一样农杆菌株类型chv基因决定了其对受体细胞识别和附着能力差异。根癌农杆菌胭脂碱型和琥珀碱型生长快、不结球，转化易于操作，但共培养时菌体附着能力较差：章鱼碱型则生长慢、易结球，转化难于操作，但共培养时菌体附着后不易洗去。2、共培养介质细菌培养基：受体植物为农杆菌宿主，所需共培养时间短；植物受体培养基：含有通用性，尤其适合共培养时间较长植物。不然易造成农杆菌过分繁殖，造成植物外植体呼吸作用抑制和细菌分泌物毒害。

基因工程综合实验第25页3、侵染浓度和时间

浓度过高、时间过长会引发农杆菌细胞间竞争性抑制，而且过分增殖会抑制受体细胞呼吸作用；浓度过底、时间过短则造成受体细胞表面农杆菌附着不足。禾谷类作物普通侵染浓度较高，接种浓度为OD600＝1.0－2.0；侵染时间1-2小时。烟草、大白菜等对侵染敏感双子叶植物要求菌体浓度要低多,普通为OD600=0.5；侵染时间5－10分钟。基因工程综合实验第26页4、共培养条件

（1）共培养温度农杆菌在20~30℃范围内都能够生长

vir区基因表示适宜温度多在20~25℃共培养温度25℃左右

外植体生长温度通常在25－26℃左右（2）共培养PH值酸性培养环境有利于农杆菌侵染。因为植物细胞释放对农杆菌有趋化作用化学物质（如酚类、糖类）即使在不一样酸碱度下比较稳定，但在pH=5.0－5.8时对vir基因诱导能力最高。

基因工程综合实验第27页

（3）诱导物和抑制物酚类是vir区基因表示主要信号物质。是否添加视植物种类不一样而异。宿主植物不需添加。（4）共培养时间

T~DNA整合表示需要16小时以上。共培养时间要视植物类型而异，如烟草、生菜和花生普通在2天左右；水稻、玉米和小麦等禾谷类作物普通为3天；西瓜、甜瓜等瓜类以4－6天为佳。5、其它影响原因

外植体类型，外植体生理状态、抑菌剂种类等。基因工程综合实验第28页试验所用器皿及试剂1、器皿与材料

—超净工作台

—光照培养箱

—28℃恒温摇床

—高速离心机

—1.5ml无菌Eppendorf管

—微量移液器及各种型号吸头

—镊子、刀子等

—培养皿

—含目标基因农杆菌

—NC89烟草叶片2、药品试剂

—卡那霉素（50mg/mL）

—利福平（30mg/mL）

—羧苄青霉素(250mg/mL)

—乙醇溶液（70%）

—0.1%氯化汞溶液基因工程综合实验第29页操作程序1、培养基配制—YEP培养基（参见细菌培养基配制）——预分化培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖30g/L，6-BA3mg/L，NAA0.2mg/L，pH5.8，琼脂9g/L。——MS0培养液及共培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖30g/L，pH5.8（注：共培养基添加琼脂9g/L）——选择培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖30g/L，6-BA3mg/L，NAA0.2mg/L，pH5.8，琼脂9g/L，卡那霉素100mg/L，羧卞青霉素500mg/L（注：卡那霉素和羧苄青霉素在冷却到60℃时加入倒制平板）——生根培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖20g/L，pH5.8，琼脂9g/L，羧卞青霉素250mg/L（注：羧苄青霉素在倒制平板前加。基因工程综合实验第30页培养基配置一组：预分化培养基：1000ml（500ml/瓶、2瓶，）分装后封口，高压灭菌，冷却至60℃分装平板40皿。大量元素20X母液

50ml/L微量元素100X母液

10ml/L维生素100X母液10ml/L铁盐100X母液10ml/L蔗糖定溶后调pH5.8

琼脂粉9g/L（每瓶4.5g）30g/L3mg/L0.2mg/L6-BANAA基因工程综合实验第31页

琼脂粉大量元素20X母液/L

50ml/L微量元素100X母液/L

10ml/L维生素100X母液10ml/L铁盐100X母液10ml/L蔗糖定溶后调pH5.89g/L（每瓶4.5g）30g/L二组：共培养培养基：1000ml（500ml/瓶、2瓶）分装后封口，高压灭菌，冷却至60℃分装平板40皿。基因工程综合实验第32页三组：选择培养基：1200ml（300ml/瓶、4瓶）分装后封口，高压灭菌，冷却至60℃，加入卡那霉素和羧苄青霉素，分装平板皿。大量元素20X母液

50ml/Lx1.2微量元素100X母液

10ml/L维生素100X母液10ml/L铁盐100X母液10ml/L蔗糖定溶后调pH5.8

琼脂粉9g/L30g/L3mg/L0.2mg/L6-BANAA

羧苄青霉素

500mg/L卡那霉素100mg/L基因工程综合实验第33页大量元素20X母液/L

50ml/Lx1.8微量元素100X母液/L

10ml/L维生素100X母液10ml/L铁盐100X母液10ml/L蔗糖定溶后调pH5.830g/L四组：MS液体培养基：1800ml（150ml/瓶、12瓶）

分装后封口，高压灭菌。基因工程综合实验第34页

五组

YEP农杆菌培养基：300ml（50ml/瓶、6瓶，）

蛋白胨10g/L

酵母粉10g/LNaCl5g/L

定溶分装后，封口，高压灭菌六组无菌水：24瓶（150ml/瓶）无菌三角瓶100ml12个，50ml70个无菌滤纸12包

50ml离心管12个

基因工程综合实验第35页2、基因转化

注：以下操作均须在超净工作台上进行，所需器皿均须灭菌

1、烟草Nc89种子催芽后，播种于塑料盘中，常规管理，至2-3

片真叶期，备用。

2、将农杆菌（内含带卡那霉素抗性基因表示载体），在固体

LB（含卡那霉素50mg/L，利福平20mg/L）培养基上划线接种；在28℃、黑暗条件下培养3天。

3、挑取农杆菌(携带重组质粒农杆菌单菌落)接种于含有

50mg/L卡那霉素YEP液体培养基中，28℃，250rpm，振荡培养约48小时,至对数生长后期。基因工程综合实验第36页4、将处于对数生长后期农杆菌液，在无菌离心管中，

3000rpm，离心5分钟；用液体MS0重悬浮，稀释3倍（OD600=0.4~0.6），用于转化。5、取烟草叶片，用水洗去表面污物，吸干多出水分，用70%

乙醇消毒30秒，再用0.1%HgCl2

消毒10分钟，用无菌水冲洗

5次，灭菌滤纸吸去表面水，用刀片切成小块(0.5×0.5cm2)

左右。6、将切好烟草叶片，平放于预分化培养基中，25℃，光照时间16小时/天，光照强度LX，预培养2天。7、将预培养后烟草叶片浸入同时准备好菌液中10分钟，中间摇动几次；然后用灭菌滤纸吸干多出菌液，接入共培养基；弱光下，28℃，共培养2-3天（外植体基部可见微菌落）。基因工程综合实验第37页8、共培养后外植体先用含羧卞青霉素500mg/L无菌水洗涤3

次，再用含羧苄青霉素500mg/LMS0培养液洗1次，然后用灭菌滤纸吸干，转入选择培养基上，恒温培养(条件同预培养)；每15天更换一次培养基。9、待芽长至1cm左右时，切下，移入MS生根培养基中，若20-30天后，转基因苗将会生根。10、待根系发育好后，移入盛有没有菌土（基质）花盆中（注意洗净根部培养基），用塑料薄膜保湿2天后，温室常规管理。反抗性苗进行抗性判定.基因工程综合实验第38页

选择培养（转化）芽分化生根

预培养共培养选择培养（未转化）基因工程综合实验第39页试验结果描述：选择培养3周后，观察试验结果。发觉烟草叶片周围产生大量愈伤组织，并有芽点产生。表明，外源基因可能已整合与烟草基因组中。基因工程综合实验第40页思索题1、在植物基因转化中，应用农杆菌主要有哪两种类型？2、依据农杆菌染色体毒性(chv)基因不一样（合成冠廮碱不一样），又分别分为哪些类型？3、农杆菌介导植物基因转化中，Ti质粒作为基因转化基因载体，主要有哪两种形式？4、将双元载体导入农杆菌方法。5、在农杆菌介导基因转化中，常见共培养介质有哪几个？6、在农杆菌介导基因转化中，用于诱导vir区基因活化酚类物质主要有哪些？基因工程综合实验第41页7、植物基因转化中应用DNA直接吸收转化法主要包含哪些？8、在用农杆菌侵染植物外植体时，菌液浓度过高或高低，侵染时间过长或过短，均会造成转化效率降低，为何？（作业）9、农杆菌介导基因转化中，培养时间要视植物类型而异，如烟草、生菜和花生普通在2天左右；水稻、玉米和小麦等禾谷类作物普通为3天；西瓜、甜瓜等瓜类以4~6天为佳。10、农杆菌介导基因转化中，共培养温度普通为多少度？，共培养基pH普通为多少？。11、农杆菌介导基因转化中，T-DNA完成转移所必需两个条件是什么？（作业）12、描述农杆菌介导烟草基因转化基础步骤。

基因工程综合实验第42页转基因植物分子分析

对转基因植物进行分子分析，常在三种水平进行检测外源基因整合和表示。DNA水平是否整合PCRSouthernRNA水平是否转录Northern蛋白质水平是否翻译WesternELISA基因工程综合实验第43页试验九植物总DNA提取

原理：（二破、一抽、一沉）植物细胞中总DNA包含：核DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA

破壁：液氮研磨破膜：SDS或CTAB一类去污剂抽提：大多数蛋白可经过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大个别RNA则可经过经处理过RnaseA除去多糖类杂质去除较困难，经过暗处理，乙醇分级沉淀沉淀：异丙醇或乙醇

基因工程综合实验第44页影响植物DNA提取得率和质量原因1、材料选取时，应尽可能选幼嫩叶片（3-4叶）。2、液氮研磨要充分，快速，不然影响裂解效果。3、再裂解过程和抽提过程中，中间摇动几次，增加材料和裂解液接触。4、抽提液中饱和酚PH值应靠近8.0，这么可降低离心后水酚双面交界面上有DNA滞留。5、在沉淀DNA时加入NaAc混合后，应放置几分钟，使Na+与DNA结合形成盐，这么在异丙醇或乙醇中盐不轻易被溶解。6、操作过程中，动作应迟缓，降低机械损伤，确保基因组DNA完整性。基因工程综合实验第45页提取DNA检测

带型弥散：DNA降解1、电泳法：琼脂糖凝胶电泳前面量多含有RNA

点样孔亮带蛋白或杂质2、光吸收法：检测260nm和280nm光吸收值。大于2.0RNA多RNase

小于1.8杂质或蛋白多抽提3、核酸浓度计算：OD260x50ng/ulx稀释倍数基因工程综合实验第46页试验所用材料、仪器和试剂1、主要试验材料

植物材料：转马铃薯Y病毒外壳蛋白基因转基因烟草叶片引物：

PVY-5：GCAAATGACACAATGCATGCPVY-3：TCACATGTTCTTGACTCCAA基因工程综合实验第47页2、主要仪器和器皿

基因工程综合实验第48页基础原理和用途

离心技术是借助于离心机旋转所产生离心力，依据物质颗粒沉降系数、质量、密度及浮力等原因不一样，而使物质分离技术。伴随生物化学、分子生物学和生物工程发展，离心分离技术已在科研、生产中广泛应用。尤其是超速离心技术已经成为分离、纯化和判别各种生物大分子主要伎俩之一。基因工程综合实验第49页离心机分类及用途低速离心机：转速为8000rpm以下；相对离心力为10000g以下；主要用于分离细胞、细胞碎片及培养基残渣等颗粒物，也用于粗结晶较大颗粒分离。高速离心机：转速为10000～25000rpm；相对离心力为10000～

100000g；主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大细胞器等。为了预防高速离心过程中温度升高而使酶等生物分子变性失活，有些高速离心机设有冷冻装置，所以叫做冷冻离心机。超速离心机：转速为25000～80000rpm；最大相对离心力为

500000g；为了预防温度升高和降低空气阻力和磨擦，超速离心机设有冷冻和真空系统。主要用于生物大分子、细胞器和病毒等分离、纯化。基因工程综合实验第50页仪器型号和控制面板5810R型高速冷冻离心机控制面板shortfasttemptempprogspeedtimestartstop▽△open基因工程综合实验第51页操作规程1、插上电源，按离心机右侧壁上“I/O”键打开电源开关，仪器自检，依次显示eppendorf5810RV5.4如上图控制面板显示器所表示介面。2、按“open”键打开离心机盖，依据离心样品体积和样品离心要求选择适当转子和离心管，将转子放置在轴上并用六角螺丝刀拧紧。3、旋上转子盖，轻轻按下离心机盖，电子锁自动锁上机盖。按控制面板上“temp”键，此时该键上方所对应数字闪烁，按“△”或“▽”键设定所需温度，然后按控制面板上“fasttemp”键，然后机器会依据转子型号自动运行一个离心程序，使离心室温度快速降至所需温度（抵达设定温度后，机器会发出提醒音）。基因工程综合实验第52页4、待机器发出提醒音后，按“open”键打开机盖，旋开转子盖，将装有样品且平衡好离心管对称放入转子中，旋上转子盖，盖好机盖。

[说明]

（1）假如此次离心不需要很长时间，则能够在上述操作后，按住“short”键，此时机器会运行“short”程序进行离心，此时操作面板上“prog”上方所对应数字会显示“SH”字样。按“short”键时间长短，会决定转速高低，当放开手后，转子转速会逐步降低直至到零，“open”键灯亮，按“open”键打开机盖，旋开转子盖取出样品。（2）假如此次需要确保离心时间，则按下述操作进行。基因工程综合实验第53页5、按控制面板上“speed”键，此时该键上方所对应数字闪烁，按“△”或“▽”键设定离心所需转速。另外，连续按两次“speed”键，该键上方所显示数值则是离心力值，按“△”或“▽”键可设定所需离心力值大小来完成离心。依据离心要求选择。6、按控制面板上“time”键，此时该键上方所对应数字闪烁，按“△”或“▽”键设定所需离心时间。另外，连续按两次或者三次该键，则能够调整转速升高或者降低加速度梯度值，可依据离心样品不一样需要进行调整。

[说明]

（1）设置完成后假如要保留此次设置参数，能够连续按两次“prog”键，此时该键上方对应数字闪烁，按“△”或“▽”键选择要保留在哪个文件名下，选择完成，按住“prog”键直至屏幕显示“ok”后，放开手，这时此次设置参数就被保留了。基因工程综合实验第54页

下次离心如需要一样离心参数时，不用按其它按键设定，只需要按下“prog”键，然后按“△”或“▽”键找到程序名就能够直接“start”键开始进行离心。（2）假如不要保留此次设置参数，能够直接按“start”键进行离心。此时“prog”键上方对应数字显示为“0”

（“0”表示未保留当前运行程序）。7、离心时间结束后，速度会逐步降低，到零时“open”键灯亮，可按该键使机盖打开，旋开转子盖取出样品。8、关闭机器时，先按控制面板上“”键关闭控制面板电源，再关闭机器侧壁“I/O”开关，拔下插入外电网电源插头。基因工程综合实验第55页注意事项1、离心机移动后,最好4个小时后再使用。2、检验离心机电源插座能否负担离心机使用功率(250V,10A)。3、离心机使用时离心套管一定要对称放置，并质量相等。4、离心开始前必须检验转子盖是否旋好，而且盖好机盖。5、因为控制面板上面按键是触摸式，所以在设置参数时不要用力去按按键，以免造成按键失灵。当所设置参数到达最大或者最小值时，再继续按“△”或“▽”数值显示不会变动，这时就不要再继续按按键了。6、使用完机器后不要马上盖上机盖，应等离心室内壁化霜，清理洁净后，再盖上机盖。7、关闭机器时一定要记住，先按控制面板上“”键，关闭控制面板电源，在关闭机器侧壁开关，拔下插头。8、转子长久不用时，一定要取出，再次使用时注意使用润滑油。基因工程综合实验第56页1.提取缓冲液（120ml，12个样品）配制

——尿素51g

——1MTris.CI（pH8.0）6ml

——0.5MEDTA（pH8.0）2.4ml

——3.5MNaCI12ml

——苯酚7.5ml

——10%SDS12ml

——10%LDS12ml

试剂配好后定容至120ml，65℃水浴中溶解。然后加入0.3g亚硫酸氢钠，分装于11个50ml离心管中（每管10ml），置于冰水中。试验操作程序（一）转基因植物总DNA提取

所用抽提缓冲液应在用前配制，加入亚硫氢酸钠后，易氧化，不能过夜。亚硫氢酸钠应避光保留。基因工程综合实验第57页2、提取程序1）取新鲜转基因烟草叶片2g，加入足量液氮充分研磨后，移入盛有提取液离心管中，震荡数秒中，然后置于冰水中20分钟，中间震荡2-3次。每次研磨材料量不宜过多，操作应快。

液氮研磨移入离心管基因工程综合实验第58页

置冰上20min振荡2－3次基因工程综合实验第59页2）10000r/min，4℃，离心15分钟。3）取上清液，加入3.5ml3MNaAC（pH5.3），混匀，再加2ml氯仿：异戊醇（24：1），轻轻混匀后，冰水中放置20分钟。

离心倒出上清基因工程综合实验第60页4）10000r/min，4℃，离心15分钟。5）取上清液，加入等体积冷异丙醇，颠倒试管混匀，冰水中放置10分钟。

取上清加入异丙醇基因工程综合实验第61页6）用吸管捞出絮状DNA，离心1min使DNA到管底，经70%乙醇洗涤2次后，干燥，加500ulTE缓冲液，65℃水浴中溶解。

沉淀DNA絮状DNA捞出DNA7）加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，即混匀后,1rpm离心5min,取上清。再用等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，取上清。加入1/10体积3MNaAC（pH5.3），2倍总体积冷无水乙醇沉淀DNA。基因工程综合实验第62页8）-20℃放置10分钟至数小时，室温，1r/min，离心5分钟。9）沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥后，加入50ulTE回溶，

-20℃保留。

洗涤DNA干燥DNA基因工程综合实验第63页思索题1、描述植物总DNA提取基础过程。(作业)2、植物总DNA主要包含：核DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA。3、植物总DNA提取方法中，破坏细胞膜常见阴离子去污剂有：SDS、CTAB等。4、在植物总DNA提取过程中，蛋白质、RNA及多糖等杂质去除，常采取什么方法？（作业）5、纯化DNA时，普通先用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次，再用氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，最终用乙醇或异丙醇沉淀。基因工程综合实验第64页试验十酶联免疫吸附（ELISA）技术原理：

ELISA为酶联免疫吸附法（Enzyme-linkedImmunoSorbentAssay）简称。利用抗原和抗体特异结合特点，将抗原直接或间接地固定在固相，然后使其与酶标抗体反应，再加入酶底物，利用酶与底物呈色反应，来判断抗原存在及浓度。辣根过氧化物酶—邻苯二胺；碱性磷酸酶—4-硝基酚磷酸基因工程综合实验第65页ELISA检测程序包含抗体或抗原包被、免疫反应及检出。包被就是将抗原或抗体固定在固相载体表面，亦称包埋。包被可采取物理吸附或共价交联方法。包被好坏是影响固-液抗体-抗原反应主要原因之一。

ELISA中最常见固相载体是多孔聚苯乙烯微量反应板。聚苯乙烯微量反应板对蛋白质有较强物理吸附作用，与蛋白类抗原（体）结合较强。使用聚苯乙烯反应板时，应用低离子强度并偏碱性包被液，因在此条件下蛋白质易被吸附，缓冲液pH值在6.0以下时，非特异性吸附会有所增加。聚苯乙烯微量反应板基因工程综合实验第66页

加入酶标抗体抗原吸附加入酶标抗体(如羊抗兔)抗体(如兔抗抗原)与抗原结合

加入酶底物,呈有色反应B抗原抗体抗原与抗原结合(捕捉抗原)加入酶底