生物制药技术专家讲座

第三章细胞工程制药生物制药技术专家讲座第1页细胞工程(cellengineering)是指应用当代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学理论与方法，按照人们需要和设计，在细胞水平上遗传操作，并经过细胞融合、

核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要新物种生物工程技术。生物制药技术专家讲座第2页1665年英国物理学家胡克用自制显微镜发觉了细胞.胡克所用显微镜及观察栎树细胞壁生物制药技术专家讲座第3页1674年荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞细胞是一切生命活动基本结构和功效单位。生物制药技术专家讲座第4页第一节细胞融合生物制药技术专家讲座第5页

细胞融合（cellfusion)，又称体细胞杂交（somatichybridiazation），是指两个或更多个相同或不一样细胞经过膜融合形成单个细胞过程。一、细胞融合定义广义：生物制药技术专家讲座第6页细胞融合是指用人工方法使两种或两种以上体细胞合并形成一个细

胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞方法。狭义：生物制药技术专家讲座第7页Muller于1838年观察到脊椎动肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人血液中也有多核血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）血液细胞发生融合过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发觉了细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发觉仙台病毒含有触发动物细胞融合效应。1974年华裔加拿大学者高国楠创建了聚乙二醇（PEG）化学融正当。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。二、细胞融合研究进展生物制药技术专家讲座第8页生物种类细胞起源成功年代烟草两个种间苷蓝——青菜大豆——马唐草矮牵牛——龙面花大麦——花生大麦——大豆小麦——矮牵牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麦——蚕豆大豆——草香木犀酵母菌——鸡大豆——烟草大豆——秋水仙人——胡萝卜番茄——马铃薯人——小鼠叶——叶叶——根愈伤组织——叶叶——花瓣种子——种子叶——悬浮细胞叶——花瓣叶——悬浮细胞叶——悬浮细胞悬浮细胞——悬浮细胞叶——根悬浮细胞——叶原生质体——血红细胞悬浮细胞——叶悬浮细胞——叶腹水癌细胞——原生质体叶——根尖纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几个细胞融合成功例子生物制药技术专家讲座第9页植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合细胞

生物制药技术专家讲座第10页动物细胞融合试验使用小白鼠生物制药技术专家讲座第11页三、细胞融合意义理论上说任何细胞，都有可能经过体细胞杂交而成为新生物资源。这对于种质资源开发和利用含有深远意义。融合过程不存在有性杂交过程中种性隔离机制限制，为远缘物种间遗传物质交换提供了有效路径。体细胞杂交产生杂种细胞含有来自双亲核外遗传系统，从而产生新核外遗传系统。生物制药技术专家讲座第12页四、细胞融合方法诱导细胞融合方法有3种:生物方法(惯用仙台病毒)化学方法(惯用聚乙二醇)物理方法

(电激和激光)

生物制药技术专家讲座第13页1、仙台病毒法①两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；②经过病毒与原生质体或细胞膜作用使两个细胞膜间相互渗透，胞质相互渗透；③两个原生质体细胞核相互融合，两个细胞融为一体；④进入正常细胞分裂路径，分裂成含有两种染色体杂种细胞。

仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：生物制药技术专家讲座第14页病毒促使细胞融合主要步骤以下：①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；③细胞膜连接部穿通，周围连接部修复，此时需Ca2+和ATP；④融合成巨大细胞，仍需ATP。生物制药技术专家讲座第15页用灭活病毒诱导动物细胞融合过程示意图

生物制药技术专家讲座第16页聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于

200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml

培养液为1g重)，即成50％PEG溶液。PEG经高压灭菌后，与温热Engle氏液混合。通惯用分子量低于1000PEG作融合剂最好，50％PEG溶液能产生最多杂交细胞。PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。2、聚乙二醇（PEG）法生物制药技术专家讲座第17页聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程生物制药技术专家讲座第18页PEG作用机理：因为PEG分子含有轻微负极性，故能够与含有正极性基团水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成份子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜融合；另外，PEG能增加类脂膜流动性，也使细胞核、细胞器发生融合成为可能。

PEG诱导融合特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。

生物制药技术专家讲座第19页聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤（1）将两种不一样亲本细胞各5×l06混匀；（2）离心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；（4）加9ml培养液，离心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养液至5ml，37℃CO2培养箱中培养。（6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。生物制药技术专家讲座第20页生物制药技术专家讲座第21页3、电融正当电融正当是80年代出现细胞融合技术，在直流电脉冲诱导下，细胞膜表面氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整膜，形成融合体。电融正当优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；免去PEG诱导后洗涤过程、诱导过程可控性强。生物制药技术专家讲座第22页电融合基本过程：细胞膜接触：当原生质体置于电导率很低溶液中时，电场通电后，电流即经过原生质体而不是经过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜击穿：原生质体成串排列后，马上给予高频直流脉冲就能够使原生质膜击穿，从而造成两个紧密接触细胞融合在一起。

生物制药技术专家讲座第23页电融合诱导法原理示意图生物制药技术专家讲座第24页五、影响细胞融合原因1、亲本细胞表面性质2、亲本细胞种类3、细胞融合时温度和运动状态4、通氧状态5、PEG6、离子浓度及种类7、PH值

生物制药技术专家讲座第25页六、细胞融合基本操作过程①制备原生质体

因为微生物及植物细胞含有坚硬细胞壁，所以通常需用酶将其壁降解。动物细胞则无此障碍。

②诱导细胞融合

两亲本细胞(原生质体)悬浮液调至一定细胞密度，按适当百分比混合后，逐步滴人高浓度聚乙二醇(PEC)等诱导融合，或用电激方法促进融合。

③筛选杂合细胞

将上述混合液移到特定筛选培养基上，让目标杂合细胞生长，其它细胞无法生长。藉此取得含有双亲遗传特征杂合细胞。生物制药技术专家讲座第26页植物细胞融合过程人造小鼠培育过程示意图生物制药技术专家讲座第27页七、杂种细胞筛选依据已经发生融合细胞中所含有核类型，可将其分为以下几个类型：异核细胞：非同源细胞融合体。同核细胞：两个相同细胞融合体。多核细胞：含有双亲不一样百分比核物质融合体。生物制药技术专家讲座第28页惯用杂种细胞筛选方法：基于酶缺点型细胞和药品抗性所建立杂种筛选基于营养缺点型细胞所建立杂种筛选由温度敏感型细胞组成杂种细胞筛选含有所需性状杂种细胞筛选生物制药技术专家讲座第29页第二节动物细胞培养技术及其应用生物制药技术专家讲座第30页一、经过动物细胞培养可生产生物制品1、病毒疫苗2、非抗体免疫调整剂3、多肽生长因子4、激素5、酶6、病毒杀虫剂7、肿瘤特异性抗原8、单克隆抗体9、细胞本身生物制药技术专家讲座第31页二、动物细胞形态和生理特点1、动物细胞形态动物细胞属于真核细胞，结构复杂，分化准确，不一样细胞执行不一样功效，含有不一样形态。但细胞在离体培养时形态会发生改变，依据不一样需要将离体培养细胞分为：

贴壁细胞、悬浮细胞和兼性贴壁细胞。生物制药技术专家讲座第32页（1）、贴壁细胞（anchoraged-dependentcell

）

生长时必须要有给以贴附支持物表面，细胞依靠本身分泌或培养基中提供贴附因子才能在该表面上生长和繁殖。

大多数动物细胞都属于这类。

贴壁细胞在表面上生长时有两种形态:成纤维样细胞型和上皮样细胞型。生物制药技术专家讲座第33页（2）、非贴壁细胞（anchoraged-independentcell）

生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长。如：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和一些转化细胞，Namalwa细胞。

（3）兼性贴壁细胞对支持物依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。

如：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。理想药品生产细胞系生物制药技术专家讲座第34页2、动物细胞生理特点

（1）分裂期长，细胞生长迟缓，易受微生物污染，培养时需要抗生素。（2）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。（6）动物细胞蛋白质合成在内质网上进行，多数为糖蛋白，需要糖基化。（3）正常二倍体细胞寿命是有限，正常二倍体细胞传代培养都是有限。（4）动物细胞对周围环境十分敏感。（5）动物细胞对培养基要求很高。生物制药技术专家讲座第35页

动物细胞能准确地转译和加工较大或更复杂克隆蛋白质;多半可分泌到细胞外，提取纯化方便;蛋白质经糖基化修饰后与天然产物更一致，适合于临床应用。动物细胞作为宿主细胞生产药品优点：缺点：培养条件要求高、成本高、产量低。生物制药技术专家讲座第36页三、生产用动物细胞取得直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化后取得细胞悬液。1、原代细胞生物制药技术专家讲座第37页原代细胞经过传代、筛选和克隆，从而从各种细胞成份组织中挑选并纯化出某种含有一定特征细胞株。2、二倍体细胞生物制药技术专家讲座第38页经过转化形成，变成了异倍体，有没有限增殖能力。转化可自发，在传代过程中自己转变成可无限增殖细胞；也可人为转化，采取一些试剂处理，或从动物肿瘤组织中建立细胞系。3、转化细胞系

生物制药技术专家讲座第39页惯用生产用动物细胞：WI-38：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，倍增时间为24小时，有限寿命50代，用于制备疫苗。

MRC-5：人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命42-46代，用于制备疫苗。

CHO-K1：从中国仓鼠卵巢中分离上皮样细胞，用于构建工程菌。

BHK-21：从仓鼠幼鼠肾脏中分离。成纤维样细胞，用于构建工程菌，可生产疫苗。

Vero：从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖成纤维细胞，用于制备疫苗。

Namalwa：从淋巴瘤病人分离，生产干扰素。

SP2/0-Ag14：从抗羊红细胞活性小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系融合取得，生产单克隆抗体。生物制药技术专家讲座第40页四、动物细胞培养条件和培养基1、动物细胞在体外培养所需条件（1）水质要求：培养时常采取经活性炭、微滤、超滤、反渗透四级净化处理制得到达国家标准纯

净水。（2）pH：影响细胞存活力，生长及代谢，细胞生长最适pH因细胞类型不一样而异，范围为7.0-7.5。

（3）渗透压：在细胞培养全部操作中，为了使与细胞接触全部液体都保持较适当渗透压

和pH,都必须采取等渗溶液。

（4）温度：动物细胞对温度尤其敏感，普通动物细胞尤其是哺乳动物细胞最正确培养温度为(37士0.5℃)。（5）溶氧：确保有适量氧气供给。

（6）灭菌：全部与细胞接触设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，防止污染。生物制药技术专家讲座第41页2、动物培养基种类和组成（1）、天然培养基：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。（2）、合成培养基：组成稳定、可大量生产供给，成份为氨基酸、维生素、糖类、无机盐、小牛血清等。（3）、无血清培养基：在天然或合成培养基基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其它元素。生物制药技术专家讲座第42页（1）提供激素及低分子量营养物。（2）提供结合蛋白质，能识别维生素、脂类、金属和其它激素等。（3）有些情况下，结合蛋白能与有毒金属和热原结合，起到解毒作用（4）起酸碱度缓冲剂作用。（5）提供蛋白酶抑制剂，使细胞传代时使用胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。血清主要功效：生物制药技术专家讲座第43页（1）在进行激素和药品研究时，血清成份与激素或药品结合结果，干扰了其对细胞作用。（2）在进行细胞营养研究时，因为血清组成复杂和不稳定，妨碍对细胞营养要求确实切了解。血清对试验负面影响：（3）干扰对培养细胞释放产物分析（4）血清只能过滤消毒，过滤消毒只能除去细菌，但不能除去血清中可能含有病毒和支原体。（5）血清中可能有抑制病毒原因，干扰病毒研究试验。

生物制药技术专家讲座第44页五、动物细胞大规模培养技术1、动物细胞大规模培养方法(1)悬浮培养（2）贴壁培养（3）贴壁-悬浮培养①微载体培养②包埋培养③微曩培养生物制药技术专家讲座第45页(1)悬浮培养所谓悬浮培养，是指细胞在生物反应器中自由地悬浮于培养基中生长增殖过程。

优点：操作简便，培养条件较均一，传质和传氧很好，放大效应小，设备相对简单，能够借鉴微

生物工程经验。

缺点：细胞密度较低。生物制药技术专家讲座第46页（2）贴壁培养贴壁培养是让细胞贴附于某种固体表面生长繁殖培养方法。优点：适用细胞种类广，较轻易使细胞到达较

高密度。生产上普通采取转瓶培养，含有投资少、设备简单、技术成熟、重现性高、放大只是简单地增加转瓶数优点缺点：劳动强度大、操作手续繁琐、占用空间大、按体积

计算产率低、监测和控制环境条件受到限制等。生物制药技术专家讲座第47页（3）贴壁-悬浮培养①微载体培养微载体培养即

是指将贴附着贴壁细胞微载体悬浮于培养基中，使细胞在微珠表面生长繁殖培养方式。

优点:a.比表面积大，它单位体积培养基细胞产率高;b.含有悬浮培养和贴壁培养两种培养优点，简化了细胞生长各种环境原因检测和控制，培养系统重现性好;c.用简便显微镜观察即能监测出细胞在微珠表面生长情况;d.培养基利用率高;e.收获细胞过程简单;f.放大轻易；g.劳动强度小;h.培养系统占用空间小。生物制药技术专家讲座第48页②包埋培养将动

物细胞与海藻酸钠混匀(此时呈液态)，然后将这种混合液滴入到CaCl2溶液中，即形成海

藻酸钙凝胶，此凝胶颗粒如上述微载体一样可用于悬浮培养。优点：负荷量大、细胞泄

漏少、制备方法简单、细胞因被保护抗机械剪切力强、抗污染能力强。缺点：存在扩散

限制，如大分子基质不能渗透进凝胶内，颗粒太大时细胞生长不良.生物制药技术专家讲座第49页③微曩培养把生物活性物质完整活细胞或组织包在薄半透膜中，即称为微囊技术。营养物质和氧可经过膜孔进入囊内，细胞代谢小分子产物可排出囊外，分泌大分子产物，不能透过膜孔，积聚在囊内。优点：a.细胞密度大；b.产物单位体积浓度高；c.分离纯化操作经济简便,产品纯度高。缺点：但微囊技术成功率普通只有百分之五十左右，培养液用量大，囊内部分死亡细胞对产物污染。生物制药技术专家讲座第50页2、动物细胞大规模培养操作方式（1）、分批式培养分批式培养是指将细胞和培养基一次性装人反应器内进行培养。细胞不停生长，营养不停消耗，产物不停形成。经过一段时间培养后，将整个培养液(连同细胞)取出，进行产物分离。CO2培养箱生物制药技术专家讲座第51页（2）、半连续式培养半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养，是指在分批式操作基础上，取出部分反应液，剩下部分重新补充新营养成份，再按分批式操作方式进行培养。生物制药技术专家讲座第52页3.灌流式培养灌流式培养是指细胞接种后进行培养，首先新鲜培养基不停加人反应器，另首先又将反应液不停地取出，但细胞停留在反应器内，使细胞处于一个恒定营养状态。生物制药技术专家讲座第53页3、动物细胞大规模培养生物反应器①优良传质、传热、混合性能，且对动物细胞剪切力小;②理化参

数易于检测和调整控制;③可用高压蒸汽灭菌;④结构简单、清洗操作方便;⑤密封性能好。理想反应器应具备性能:生物制药技术专家讲座第54页（1）、通气搅拌反应器生物制药技术专家讲座第55页（2）、气升式生物反应器：空气提升式生物反应器两种构型：内循环式、外循环式生物制药技术专家讲座第56页

空气流速普通控制在0.01～0.06m3/m3.min,反应器高径比普通为(3:1)～(12:1)生物制药技术专家讲座第57页

（1）没有移动部件，产生湍动温和而均匀，剪切力相当小，细胞损伤率比较低。（2）完全密封，便于无菌操作，不易污染。（3）设计简单，便于放大生产。（4）直接喷射空气供氧，氧传递速率高，液体循环量大，使细胞和营养成份能均匀地分布于培养基中。优点：生物制药技术专家讲座第58页（3）、中空纤维生物反应器生物制药技术专家讲座第59页第三节植物细胞培养技术及其应用叶绿体线粒体细胞壁细胞膜液泡细胞质光面内质网细胞核粗面内质网高尔基体生物制药技术专家讲座第60页植物细胞培养技术就是为了某种目标而在细胞水平上对离体植物细胞或原生质体进行一系列生物工艺学操作。它包含分离、培养、再生以及一系列相关操作。

一、概念生物制药技术专家讲座第61页植物细胞全能性二、植物细胞培养理论基础生物制药技术专家讲座第62页

植物细胞全能性（totipotency）：指植物每个细胞都包含着该物种全部遗传信息，从而具备发育成完整植株遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都能够发育成一个新个体。

1958年，美国科学家斯图尔德将胡萝卜韧皮部一些细胞进行培养，因为细胞分化而最终发育成完整新植株。

植物体细胞培养产生完整植物示意图细胞培养形成胡萝卜植株生物制药技术专家讲座第63页

植物细胞比微生物细胞大50～

100倍。在细胞培养过程中，其细胞形态有显著改变。

三、植物细胞特征1、细胞形态特征：生物制药技术专家讲座第64页在间歇培养时，培养早期，多半是比较大游离细胞，接着便开始分裂，伴随分裂，原来较大细胞分裂成一个一个较小细胞，同时，较小细胞聚集成细胞块，在生长停顿后，细胞伸长、肥大，块状细胞游离分散。

生物制药技术专家讲座第65页

植物细胞分批培养时，细胞生长呈S型曲线，植物细胞生长速度比较迟缓。生物制药技术专家讲座第66页

诱导期对数增殖

转换

衰减期

静止04080120160200细胞浓度(g/L)培养时间(h)植物细胞生长曲线生物制药技术专家讲座第67页2、植物细胞有纤维素细胞壁，细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差。不能耐受强力通风搅拌。（普通为50～100r/min，通气为：0.5m3/m3·min）

植物细胞特征生物制药技术专家讲座第68页3、培养过程生长速度迟缓，易受微生物污染，需用抗生素。

植物细胞特征生物制药技术专家讲座第69页4、培养液粘度大，植物细胞体积大，在培养液中所占容积可高达40%～50%，植物细胞培养液粘度和微生物发酵液表现出显著不一样，它随细胞浓度增加，粘度显著上升。

植物细胞特征生物制药技术专家讲座第70页植物细胞特征5、植物细胞二级代谢产物大都送到液泡内堆积而非如微生物排出细胞外，当前产量较低。生物制药技术专家讲座第71页植物细胞培养与微生物培养比较特征微生物植物细胞大小2μm3＞105μm3

单一细胞经常普通以群体发育由单细胞生长成细胞群是少有加成时间大于1h1d接种浓度小细胞在培养液中浓度为5%～20%染色体数目单或双倍体单、双、多及不定倍体混合生长切力不敏感敏感单一培养变异安定变异很大发育可形成孢子或假菌丝形成器官或胚通气需求高，1～2m3/m3.min低，0.2～0.3m3/m3.min产物形成进入菌丝进入液泡生物制药技术专家讲座第72页四、植物细胞培养条件（一)、外植体制备

所谓外植体是指将外界生长植物细胞和组织经过一系列无菌处理形成有活性无菌组织和细胞。制备外植体标准是无菌和有活性，假如外植体被微生物污染则难以存活。生物制药技术专家讲座第73页（二）、无菌操作无菌操作是贯通于整个组织培养过程一门关键技术，甚至能够说组织培养前提就是无菌。实际上外植体制备过程就是无菌处理过程，而其后一系列操作都是在无菌环境下进行。生物制药技术专家讲座第74页（三）、人工培养环境能否把植物组织培养做到满意人工调控，关键在于人工培养环境，包含光照、温度、

湿度、培养基等。生物制药技术专家讲座第75页培养基包含植物生长必需16种营养元素和一些生理活性物质。全部这些物质可概括为5大类：

1、植物细胞培养基营养成份生物制药技术专家讲座第76页

有13种植物必需元素N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl，前6种为大量元素，后7种属微量元素。I虽不是植物生长所必需，但几乎全部组织培养基中都有，有些培养基还加入Co、Ni、Ti、Be，、Al等元素。。（1）无机营养物：生物制药技术专家讲座第77页

一类是有机营养物质，为植物细胞提供C、H、O、N等必须元素，如糖类，AA等；另一类是一些生理活性物质，在植物代谢中起一定作用。如：维生素及单核苷酸等。

（2）有机物质：生物制药技术专家讲座第78页主要加入植物天然5类激素物质及其人工合成类似生长激素物质。

（3）植物生长刺激物质：植物天然5类激素物质有：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、脱落素类和乙烯类。生物制药技术专家讲座第79页

这些物质不是植物细胞生长所必需，但对细胞生长有益。如活性炭能够降低组织培养物有害代谢物浓度，对细胞生长有利。液体培养基中加入琼脂糖，可改进培养细胞供氧情况。

（4）其它附加物：生物制药技术专家讲座第80页

植物天然汁液如西瓜汁、生梨汁等，它们作用是供给一些必需微量营养成份、生理活性物质和生长激素物质等。

（5）其它对生长有益未知复合成份生物制药技术专家讲座第81页2、光

植物细胞代谢产物合成受光质和光量调整。对于黄酮、黄酮醇、花色素苷、萘醌、多酚、挥发油、萜烯和其它次级代谢合成和积累来讲，光质和光量含有主要影响。

生物制药技术专家讲座第82页

最适生长温度25～30℃，另外，温度对培养基成份利用速度也有一定影响。

3、温度生物制药技术专家讲座第83页4、pH值经过细胞膜进行H+离子传递对细胞生育环境、生理活性来说无疑是主要。在培养过程中，通常pH作为一个主要参数被控制在一定范围内。植物细胞培养适宜pH值普通为5～6。

生物制药技术专家讲座第84页5、通气通气是细胞液体深层培养主要物理化学因子。好气培养系统通气与混合及搅拌是相互关联。对摇瓶试验，通常500mL三角瓶内装80—200mL植物细胞培养液较适宜。当然，气液传质还与瓶塞材料相关。试验表明，从溶氧速率考虑，以棉花塞最好，微孔硅橡胶塞次之，铝箔塞最差。生物制药技术专家讲座第85页

Kessell和Carr在验证溶解氧对搅动通气培养胡萝卜细胞生长和分化影响时，发觉有一个临界氧水平。在临界水平之上，生长不受溶解氧影响，依据干重或细胞数目计算生长呈指数增加。而低于这个临界值时，干重增加呈线性，而细胞数目仍以指数形式增加。

生物制药技术专家讲座第86页五、植物细胞培养技术：组织培养指以分离出植物各部位组织或诱导愈伤组织为外植体离体无菌培养。用于研究植物生长发育、分化和遗传变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。1．

组织培养：人参愈伤组织生物制药技术专家讲座第87页细胞培养指以单个游离细胞(如用果酸酶从组织中分离体细胞，或花粉细胞、卵细胞)为接种体离体无菌培养。2．

细胞培养惯用植物细胞培养有花粉培养和原生质体培养两大类。生物制药技术专家讲座第88页（1）花粉培养在无菌条件下取出花药或从花药中取出花粉粒（小孢子），置于人工培养基上进行培养，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最终长成花粉植株。生物制药技术专家讲座第89页首先用纤维素酶或果胶酶除去植物体细胞细胞壁得原生质体。原生质体在良好培养基上能够生长与分裂，并经过愈伤组织诱导分化长出茎、叶，再长出根而形成植株。（2）原生质体培养生物制药技术专家讲座第90页3．

悬浮细胞培养：将植物细胞或较小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好分散状态。这些小细胞聚合体通常来自植物愈伤组织。生物制药技术专家讲座第91页六、植物细胞培养方法植物细胞培养有悬浮培养和固定化细胞培养两种。生物制药技术专家讲座第92页1、悬浮培养①.半连续培养法：每隔一定时间（如1～2天）收获部分培养物，再加入等量培养基方法。

生物制药技术专家讲座第93页②.连续培养法：即培养若干天后连续收获细胞同时不停补充培养液方法。

生物制药技术专家讲座第94页2、固定化细胞培养细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物内部或贴附在它表面。

生物制药技术专家讲座第95页（1）平床培养系统生物制药技术专家讲座第96页（2）立柱培养系统生物制药技术专家讲座第97页七、植物细胞培养产物类型植物细胞大规模培养产物有种苗、细胞、初级代谢物、次级代谢物和生物大分子等。生物制药技术专家讲座第98页

植物细胞工业规模培养首先是细胞生物量增加，细胞即为主要产品之一。如人参细胞制成人参细胞粉，既是保健食品原料，也可作为药材，其中除含人参皂苷（人参皂苷含量7%，超出了原植物）外，还含有天然人参所不含有酶类及其活性成份，其保健作用优于天然人参。日本曾用烟草细胞培养搜集烟草细胞作为烟草原料。1、植物细胞：生物制药技术专家讲座第99页当前来自植物细胞培养有用物质有400种左右，包含色素、固醇、生物碱、维生素、激素、多糖、植物杀虫剂及生长激素等数十个类别。2、初级及次级代谢物生产生物制药技术专家讲座第100页化合物细胞起源作用紫草素紫草细胞抗炎剂，食用色素辣椒素朝天椒细胞食品，化装品色素甘草精甘草细胞甜味剂香豆素薰衣草细胞香料薄荷醇薄荷细胞香料黄连素黄连细胞止泻药类胰岛素苦瓜细胞治疗糖尿病毛地黄毒素毛地黄细胞强心药利血平罗夫杉细胞降血压药奎宁碱金鸡纳树抗疟疾长春花碱长春花治疗白血病可卡因古柯植物抗阿米巴病尼古丁烟草杀虫药吗啡罂粟止痛药生物制药技术专家讲座第101页利用植物培养细胞为酶源，使某种前体化合物生成对应产物技术称为生物转化，也叫植物细胞转化。

3、生物转化生物制药技术专家讲座第102页植物细胞内含有催化酯化、氧化、还原、皂化、羧基化、异构化、甲基化、羟基化、环氧化、去甲基化等反应酶类，可使对应原料生成有用化合物。生物制药技术专家讲座第103页生物制药技术专家讲座第104页

植物细胞转化作用是个普遍存在现象，如在三角叶薯芋细胞培养物中添加胆固醇，则薯芋皂苷元产率增加1倍，在雷公藤细胞培养物中添加法尼醇（100μg/ml），使雷公藤羟内酯产量增加3倍以上，在紫草细胞培养物中添加L‑phe，使紫草素产量增加3倍。生物制药技术专家讲座第105页

1、能够不受环境原因，能在任何地方与任何时候进行生产，培养物能到达在田中生产材料中从未见到那种整齐一致程度；

八、植物细胞培养优越性生物制药技术专家讲座第106页

2、任何新发觉植物种类都能马上着手培养，并能缩短繁殖和引种栽培时间；植物细胞培养优越性：生物制药技术专家讲座第107页3、人工控制有毒药品扩散和滥用；植物细胞培养优越性：

4、植物组织培养实现工业化生产无需占用耕地，培养物生长快速，周期短，能够在人工控制条件下，采取科学方法提升产量和质量。生物制药技术专家讲座第108页九、植物细胞培养几个技术难题植物细胞生产周期普通为25～35d，因为生产效率低，设备周转慢，能源、劳力消耗多，因而成本高。

1、缩短生产周期、降低生产成本生物制药技术专家讲座第109页筛选有效成份高细胞株进行培养。2、提升培养细胞中有效成份含量生物制药技术专家讲座第110页3、预防细胞集聚成块

成块后使细胞生长速度变慢，细胞性质有差异，有效成份含量不一样，影响产品质量产量，另外造成管路堵塞等麻烦。选取涣散易分散起始材料，培养过程中随时除去细胞团块，提升生长素浓度向培养基中加入EDTA-Na螯合剂和果胶酶等。生物制药技术专家讲座第111页4、预防细胞株种性退化和变异作为原种植物细胞株保留，是依靠定时继代培养方法实现，这不但操作麻烦，且易产生突变，引发种性退化。生物制药技术专家讲座第112页十、药用植物细胞培养研究1.药用植物次生代谢产物药用植物次生代谢产物是指药用植物体内一大类化合物，它们是细胞生命活动或植物生长发育正常运行非必需小分子化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期特异性。

生物制药技术专家讲座第113页不一样药用植物次生代谢产物合成和积累经常在不一样部位，且药用植物次生代谢物种类繁多，结构迥异。生物制药技术专家讲座第114页2.药用植物细胞培养技术在次生代谢产物生产中，药用植物细胞培养技术是经过给予体外生长植物细胞一定营养条件，使其生长，并依据植物或植物不一样组织细胞调整生长条件来获取所需次生代谢产物生物技术。生物制药技术专家讲座第115页因为植物体内任何一个细胞都包含有整体植物全部遗传信息，在一定条件下含有发育成一个完整植株能力，所以经过细胞培养技术可得到药用植物次生代谢产物。

生物制药技术专家讲座第116页3.药用植物细胞培养研究进展从1939年P.R.White和R.J.Gautheret建立了植物细胞和器官培养技术以来，经科学家们半个世纪努力，当前药用植物细胞培养技术在选材消毒、接种培养、诱导筛选、继代保留、成份分离判定和工业化生产方面已发展成一门精细试验科学，并已建立了一套操作程序。

生物制药技术专家讲座第117页20世纪60年代愈伤组织、细胞悬浮和细胞发酵培养20世纪70年代植物细胞培养技术规模已到达了中试水平20世纪80年代是药用植物细胞工程研究取得重大突破黄金时代到了90年代，国内药用植物细胞培养技术取得了很大进展生物制药技术专家讲座第118页第四节杂交瘤技术与单克隆抗体生物制药技术专家讲座第119页

包含特异性免疫(Specificimmunity)和非特异性免疫。

一、免疫系统生物制药技术专家讲座第120页个体反抗原性异物抵抗力，有些是天生，即在发育进化过程中形成，经遗传取得，称为先天性免疫。因其并非针对某一特定病原微生物，故又称为非特异性免疫。非特异性免疫生物制药技术专家讲座第121页个体在生活过程中，因受到一些病原微生物感染或接种疫苗而取得免疫称为取得性免疫。因这种免疫普通针对所感染病原微生物或疫苗所能预防疾病，故又称为特异性免疫。特异性免疫：生物制药技术专家讲座第122页当机体受到抗原刺激后，一类小淋巴细胞-依赖胸腺T细胞发生增生、分化，直接攻击靶细胞或间接地释放一些淋巴因子，从而使机体到达免疫过程。

细胞免疫：生物制药技术专家讲座第123页当机体受到抗原刺激后，起源于骨髓小淋巴细胞-B细胞进行增生和分化为浆细胞，浆细胞产生抗体，抗体进入体液而形成特异性免疫。体液免疫：体液免疫发生分为：感应、反应和效应三个阶段。生物制药技术专家讲座第124页

单克隆抗体：单一特异性抗体即为单一B细胞克隆抗体，B型淋巴细胞增生过程是一个无性繁殖过程，即由一个B细胞分裂而形成细胞群，称为一个克隆。单克隆抗体(Monoclonalantibody,McAb)也称为单抗。多克隆抗体(Polyclonalantibody)：各种B型淋巴细胞产生各种抗体混合物。

（一）、单克隆抗体二、杂交瘤技术与单克隆抗体生物制药技术专家讲座第125页单克隆抗体特点1、高度特异性5、过于单一性2、高度稳定性3、高抗体活性4、不可知性生物制药技术专家讲座第126页（二）杂交瘤技术经过杂交瘤技术取得杂交瘤细胞具备两种亲本细胞特征。

杂交瘤技术包含免疫动物、细胞融合、筛选杂交瘤细胞、克隆化培养、单克隆抗体制备与判定等步骤，其关键技术是细胞融合技术。生物制药技术专家讲座第127页利用杂交瘤技术生产单克隆抗体经历了一个漫长发展阶段。

1975年，英国Milstein和Kohlor将经绵羊细胞免疫小鼠脾B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞在仙台病毒诱导下进行融合，利用HAT选择性培养基筛选出融合后形成杂交细胞，这种细胞现有小鼠骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量繁殖本事，又有B淋巴细胞分泌特异性抗体能力，使得单克隆抗体在体外生产成为可能。生物制药技术专家讲座第128页利用杂交瘤技术生产单克隆抗体必备条件：1、一个亲本是能产生抗体细胞2、另一亲本是能够无限生长繁殖细胞。生物制药技术专家讲座第129页杂交瘤技术免疫动物细胞融合筛选杂交瘤细胞克隆化培养单克隆抗体制备与判定单克隆抗体纯化生物制药技术专家讲座第130页（三）单克隆抗体应用：1、新型诊疗试剂：

在医学临床诊疗方面，用于体外测定病人血、尿或分泌物中各种特殊蛋白质含量，如寄生虫、细菌、病毒、癌细胞分泌蛋白质以及因为代谢病或遗传病造成特殊蛋白质等，进而判断身体是否有病，也可用来检测治疗过程中病变情况。

生物制药技术专家讲座第131页红细胞表面糖蛋白：A、B型AB型：两种都带O型：两种血型物质都不带

法国输血中心还研制出了可分辩A型、B型、AB型血型单克隆抗体诊疗盒。生物制药技术专家讲座第132页

单克隆抗体可用在体内定位诊疗上，不一样癌症或肿瘤在体内所表现出癌抗原或瘤抗原不一样，能够取得各种特异单克隆抗体，再采取适当同位素标识表使特异单克隆抗体上带有放射性标识。生物制药技术专家讲座第133页

单克隆抗体在肿瘤治疗方面当前正显示着巨大优势，其中治疗效果很好有白血病、淋巴瘤、肾癌、肉瘤、黑色素瘤、肝癌以及胃肠道肿瘤等。

2、临床治疗：生物制药技术专家讲座第134页利用抗体和抗原高度亲和特点，单克隆抗体能够广泛应用于亲和层析，分离纯化蛋白质物质。3、蛋白质提纯：生物制药技术专家讲座第135页以抗体为载体导向治疗药品研究已经有近20年历史，已制备出百余种单克隆抗体，判定出数十种与肿瘤相关抗原，但治疗试剂还没有到达商品化。

（四）抗体治疗药品

生物制药技术专家讲座第136页1、放射性核素标识抗体治疗药品抗体作为放射性核素导向载体，操作简单、用量小，且能观察到药品在体内分布和药品动力学，放射性标识抗体有较大杀伤范围，有利于克服肿瘤表面抗原异质性，对肿瘤细胞杀伤也不依赖抗原抗体结合后吸收作用，因为分子量小，轻易穿透抵达肿瘤部位。

2、抗癌药品偶联抗体药品（1）、惯用抗癌药

氨甲喋呤、阿霉素、丝裂霉素、环磷酰胺等，以人血清白蛋白为中间载体，可显著提升每分子抗体所携带氨甲喋呤量，使体外细胞毒性提升倍。（2）、抗体类药品逆转耐药性

肿瘤细胞反抗原药品可产生多药耐药性。

生物制药技术专家讲座第137页毒素偶联抗体药品

1、免疫毒素及其换代制品

毒素和抗体交联物称为免疫毒素。第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体交联物，应用有限，第二代免疫毒素利用抗体或抗体片段与毒素作用，在体内有一定抗肿瘤作用；第三代免疫毒素—重组免疫毒素，特异性好，稳定性强，渗透性好，免疫原性低，可大量制备。

2、免疫毒素制备

起源:主要是细菌毒素和植物毒素。

载体种类：小分子抗体FV和SCFV；细胞生长因子可与细胞膜上受体结合；激素，可识别细胞表面受体；CD4可识别HIV表示糖蛋白。

先克隆出细胞基因，再利用基因重组技术去除毒素中非特异性结合部位基因，经过改造毒素基因再与载体基因互补DNA重组，转入受体菌中表示，形成融合蛋白，再经纯化可得到重组免疫毒素。

3、免疫毒素临床应用

可用于治疗肿瘤、本身免疫病、并能克服组织移植排斥反应，可单独给药也可包裹在脂质体及其它微粒中给药，在胞浆物质代谢中发挥作用，相对分子量小，渗透力强、效果好。

生物制药技术专家讲座第138页抗HBsAg单克隆抗体生产工艺

抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)单克隆抗体是专一性识别HBsAg单一抗体，能与HBsAg产生免疫反应。临床上用于检测乙型肝炎病毒感染并用于生产预防乙肝免疫制剂，当前生产抗HBsAg单克隆抗体技术有基因工程与细胞工程。（五）单克隆抗体生产工艺实例

生物制药技术专家讲座第139页免疫大鼠脾淋巴细胞与大鼠骨髓瘤IR983F细胞融合技术制造抗HBsAg单克隆抗体工艺。

(1)工艺流程

大鼠骨髓瘤细胞+免疫大鼠脾淋巴细胞融合混合物杂种细胞混合物杂交瘤克隆系细胞种质培养液粗制McAb

层析液浓缩液McAb精品生物制药技术专家讲座第140页

(2)工艺过程

①培养基：大鼠骨髓瘤IR983F细胞系培养基为改良

(DMEM)培养基。使Eagle培养基中15种氨基酸浓度增加1倍，

8种维生素浓度增加3倍而成，用于细胞培养，提升了细胞生长期有效果。其中尚需10%灭活小牛血清，1%非必需氨基酸，0.1mol／L丙酮酸钠，1%谷氨酰胺及50mg／mI庆大霉素；杂交瘤细胞筛选系统用含HATDMEM培养基。

生物制药技术专家讲座第141页②喂养细胞制备：在细胞融合前2～3天，取健康大鼠处死，向腹腔内注入10mlDMEM培养液．轻压腹腔使细胞悬浮，打开腹壁皮肤，暴露腹膜，提起腹膜中心，插入注射针头，吸出全部细胞悬液；

500g离心5min，用pH7.4，0.1mol／L磷酸缓冲液洗涤2-3次；搜集细胞，用含10％小牛血清、100U／ml青霉素和链霉素及HATDMEM培养液制成106细胞／ml悬浮液；使用24孔板时，每孔加0.1ml，当使用96孔板时，则制成2x105细胞／ml悬浮液，每孔加0.1ml，然后置37℃CO2培养箱中温育，备用。

生物制药技术专家讲座第142页生物制药技术专家讲座第143页③亲本细胞准备：

取对8—氮鸟嘌呤抗性Lou／c大鼠非分泌型浆细胞瘤IR983F细胞，用常规方法制成细胞悬浮液，按1.5x105细胞／ml接种量接种于DMEM培养液中，于37℃CO2培养箱中培养至对数生长久，经常规消化分散法用DMEM培养液制成细胞悬浮液，即为待融适用骨髓瘤细胞亲本，备用。另取HBsAg用pH7.4，0.1mol／L磷酸缓冲液溶解并稀释成20μg／ml溶液，加等体积福氏完全佐剂充分乳化后，取2ml注入Lou／c大鼠腹腔，2周后进行第2次免疫，3个月后于融合前3—4天进行加强免疫，3次免疫剂量和注射路径均相同，唯第3次免疫时不加福氏佐剂，

生物制药技术专家讲座第144页于细胞融合前处死大鼠，用碘酒棉球及酒精棉球先后对右上腹部消毒，剖开腹部，用无菌剪刀与镊子取出脾脏，用pH7.4，0.1mol／L磷酸缓冲液洗去血液，在无菌烧杯或培养皿中切成1mm3小块，再用磷酸缓冲液洗涤3～4次，直至澄清，倾去洗涤液，加入组织块5～6倍体积(质量／体积)0.25%胰蛋白酶溶液(pH7.6—7.8)于37度保温，消化20一40min，每10min轻摇消化瓶1次，直至组织块松软为止，倾去胰蛋白酶溶液，再用上述磷酸缓冲液洗涤3～5次，然后加入少许磷酸缓冲液用10ml吸管吹打分散，至大部分组织块分散为细胞，用两层无菌纱布过滤，未分散组织块再加少许磷酸缓冲液吹打和分散，合并细胞滤液，离心搜集细胞并用磷酸缓冲液洗涤2—3次，然后用无血清DMEM培养液稀释制成细胞悬浮液，即为免疫大鼠脾淋巴细胞亲本，备用。生物制药技术专家讲座第145页④固定化抗大鼠K轻链单抗制备：本法所用载体也为Sepharose4B，其活化方法与制备固定化t-PA相同．取30g活化Sepharose4B悬浮于100ml，pH10.2，0.025mol/L硼酸缓冲液中，另取1g抗大鼠K轻链McAb(MARK-1)溶于25ml硼酸缓冲液，然后加至上述已活化Sepharose4B悬浮物中，于10度搅拌反应16～20h，将其装柱(直径2cm*50cm)并用10倍柱床体积(体积／体积)上述硼酸缓冲液以5—6ml／min流速洗涤柱床，搜集流出液，测A280并依据流出液计算偶联效率．然后依次用5倍柱床体积(体积／体积)pH10，0.1mol/L乙醇胺溶液及pH8.0，0.1mol／L硼酸缓冲液充分洗涤．最终用pH7.4，0.1mo/L磷酸缓冲液洗至流出液A280小于0.01，即得抗HBsAgMcAb亲和吸附剂，将其转移至含0.01NNaN3pH7.4，0.1mol磷酸缓冲液中，于4℃贮存，备用。生物制药技术专家讲座第146页

⑤细胞融合：取107个IR983F细胞与108个免疫大鼠脾淋巴细胞于50mi离心管中，混匀，在4度下，1500r／min离心8—10min，用巴斯德吸管小心吸去上清液，轻弹管底，使沉淀细胞松动，于37度水浴中保温，并于lmin内轻轻滴加0.8ml50%PEG4000，同时用吸管尖轻轻搅动60～90s，然后于2min内迟缓滴加20mlDMEM培养液，1500r／min离心8～10min，吸去上