减毒活疫苗专题知识专家讲座

第三章

减毒活疫苗减毒活疫苗专题知识专家讲座第1页第一个用于人体减毒活疫苗19，从患结核病牛乳房里分离得到一株牛型结核杆菌；Calmette和Guerin将此菌接种于5%甘油胆汁马铃薯培养基，进行传代培养；每隔2-3周传代一次，经过230余代，历时，终于制备出减毒活疫苗——卡介苗(bacilleCalmette-Guerin，BCG)。减毒活疫苗专题知识专家讲座第2页第一节减毒活疫苗原理与现实状况

减毒活疫苗专题知识专家讲座第3页一、减毒活疫苗原理

减毒活疫苗模拟自然发生感染后免疫过程。全身性感染（病毒性/细菌性感染）临床感染或亚临床感染(隐性感染)持久性免疫力临床现象减毒活疫苗专题知识专家讲座第4页1.定义减毒活疫苗经过不一样方法伎俩使病原体毒力(致病性)减弱或丧失后取得一个

疫苗制品。由完整微生物组成减毒活疫苗专题知识专家讲座第5页2.减毒活疫苗特点能引发机体感染、但不发生临床症状其免疫原性足以能刺激机体免疫系统、产生针对该病原体免疫反应在以后暴露于该病原体时，能保护机体不患病或减轻临床过程。减毒活疫苗专题知识专家讲座第6页二、减毒活疫苗使用和研究现实状况使用现实状况有已完成历史任务而退伍牛痘苗有已经并正在继续发挥其良好防病作用脊髓灰质炎、麻疹、甲型肝炎减毒活疫苗有在长久使用后又面临新挑战卡介苗有在我国使用时间不长，尚待积累功劳水痘减毒活疫苗减毒活疫苗专题知识专家讲座第7页2.传统减毒活疫苗局限与不足无法或极难用传统技术研制疫苗不能培养或难以培养病原体有潜在致癌性或免疫病理作用病原体保护效果差、副反应大或使用不方便处理方法：使用基因工程技术对其进行改造或取而代之减毒活疫苗专题知识专家讲座第8页3.国内外使用减毒活疫苗一览表分类名称接种路径国内使用国外使用病毒疫苗甲型肝炎减毒活疫苗皮下注射十—麻疹减毒活疫苗皮下注射十十腮腺炎减毒活疫苗皮下注射十十黄热减毒活疫苗皮下注射十十脊髓灰质炎减毒活疫苗口服十十乙型脑炎活疫苗皮下注射十—风疹减毒活疫苗皮下注射十十水痘减毒活疫苗皮下注射十十登革热减毒活疫苗皮下注射—十流感减毒活疫苗喷雾—十腺病毒减毒活疫苗肌内注射—十细菌疫苗炭疽减毒活疫苗皮上划痕十十布氏菌减毒活疫苗皮上划痕十十卡介苗皮内注射十十伤寒减毒活疫苗口服—十霍乱减毒活疫苗口服—十鼠疫减毒活疫苗皮上划痕

十十减毒活疫苗专题知识专家讲座第9页三、减毒活疫苗研究策略①选择标准疫苗株;②新抗原结构能诱导广泛中和抗体;③诱导在多样主要组织相容复合体(majorhistocompatibilitycomplex，

MHC)背景人群多位点CTL应答;④直接和间接地诱导传输路径黏膜免疫应答减毒活疫苗专题知识专家讲座第10页1.病原体培养

怎样减毒？体外细胞培养低温培养传代以产生冷适应株在特定温度下选育温度敏感株动物体内分段或连续传代减毒活疫苗专题知识专家讲座第11页1.病原体培养

怎样筛选？蚀斑法挑选（产生细胞病变效应病毒）同一病毒：蚀斑较大：毒力相对强蚀斑小：毒力较弱其减毒性在人体中必须是稳定减毒与免疫原性之间平衡减毒适度：确保人体使用安全良好免疫原性：足以诱生特异性免疫应答致细胞病变效应(cytopathogeniceffect，CPE)

培养单层细胞、接种病毒后造成细胞萎缩、脱落等病变现象。减毒活疫苗专题知识专家讲座第12页第一代减毒变异株12-1-7原代地鼠肾细胞(PHK)连续传代：100代SA14SA14-14-2/PDK例：乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2株乳鼠体内传代SA14-14-2/PHK蚀斑克隆病毒株SA14-5-3PHK细胞性状不稳定神经毒力返祖减毒过分，免疫原性不足PHK细胞恢复一定免疫原性蚀斑克隆原代狗肾细胞(PDK)传9代减毒与免疫原性到达平衡减毒活疫苗专题知识专家讲座第13页2.减毒策略传统方法：细胞传代动物传代蚀斑挑选化学诱变营养突变等当代方法：应用基因工程技术，删除致病基因病原体减毒更彻底遗传性能更稳定安全性和免疫原性更平衡。减毒活疫苗专题知识专家讲座第14页四、基因工程减毒活疫苗构建策略基因缺失活疫苗(genedeletedlivevaccine)将与毒力相关基因或基因片段删除，从而取得缺失突变毒株优点：突变性状明确稳定、不易发生毒力返祖减毒活疫苗专题知识专家讲座第15页四、基因工程减毒活疫苗构建策略基因缺失活疫苗(genedeletedlivevaccine)DNA病毒去除毒力基因腺病毒，可用作减毒活疫苗株，也可作为载体疫苗病毒载体。RNA病毒减毒活疫苗专题知识专家讲座第16页四、基因工程减毒活疫苗构建策略2.遗传重组疫苗(geneticrecombinantvaccine)经过强、弱毒株共同感染细胞，二者之间进行基因片段交换，而取得减毒活疫苗。特点：很大盲目性，致使筛选特定遗传重组病毒比较困难。减毒活疫苗专题知识专家讲座第17页四、基因工程减毒活疫苗构建策略2.遗传重组疫苗(geneticrecombinantvaccine)反向遗传技术发展，能够对分节段RNA病毒进行定向重配，提升重配效率。研究热点：甲型流感病毒、轮状病毒和汉坦病毒等减毒活疫苗株。减毒活疫苗专题知识专家讲座第18页载体疫苗(vectorvaccine)利用非致病微生物作为载体、递呈外源抗原一个减毒疫苗。将外源抗原基因插入到载体微生物基因组中，用这种表示外源抗原微生物作为疫苗。四、基因工程减毒活疫苗构建策略减毒活疫苗专题知识专家讲座第19页四、基因工程减毒活疫苗构建策略病毒载体疫苗痘苗病毒腺病毒麻疹病毒脊髓灰质炎病毒等细菌载体疫苗产单核细胞李斯特菌沙门菌霍乱弧菌志贺菌卡介苗小肠耶尔森菌炭疽杆菌戈登菌属乳杆菌属葡萄球菌属等载体疫苗(vectorvaccine)成本低适于群体免疫减毒活疫苗专题知识专家讲座第20页五、减毒活疫苗研究面临问题

1.安全性成功或比较成功预防性疫苗牛痘苗、脊髓灰质炎、麻疹、甲型肝炎、乙型脑炎等减毒活疫苗不太成功疫苗：卡介苗半个多世纪、40余亿人群使用对肺结核免疫保护效果：差异甚大(0-80%)迄今尚没有一个国家或地域有毁灭结核可能性改造研究是热点减毒活疫苗专题知识专家讲座第21页五、减毒活疫苗研究面临问题

2.安全性和免疫原性之间协调——难题Ty21a口服伤寒减毒活疫苗最成功营养缺点型突变营养缺点型突变人结核菌H37Rv亮氨酸缺点株残余毒力指数过高减毒活疫苗专题知识专家讲座第22页五、减毒活疫苗研究面临问题

2.安全性和免疫原性之间协调——难题霍乱减毒活疫苗：基因缺失株CVD112：保护率：84%6名志愿者中：引发3人轻度腹泻CVD-103HgR株：对不一样人群诱导

抗体应答悬殊免疫原性不恒定减毒活疫苗专题知识专家讲座第23页五、减毒活疫苗研究面临问题

3.载体疫苗研究中存在问题①载体微生物蛋白过量表示，严重干扰欲表示抗原诱导机体免疫应答;②非复制型载体微生物（如禽痘病毒）减弱或消失，造成目标抗原表示量降低，影响疫苗免疫原性;③目标抗原微生物和载体微生物感染路径不一定相同，而致使目标抗原不能经自然感染路径免疫，从而影响免疫效果。减毒活疫苗专题知识专家讲座第24页第二节

减毒活疫苗设计与制备技术要求减毒活疫苗专题知识专家讲座第25页一、减毒活疫苗设计要求设计减毒活疫苗菌株或毒株，要依据生物制品用途、使用范围、使用方式、生产过程和生产条件等原因来决定，设计时应注意以下问题：安全性免疫原性遗传稳定性生产适应性减毒活疫苗专题知识专家讲座第26页1.安全性①残余毒力残余毒力高：免疫原性：

临床反应：残余毒力低：免疫原性：临床反应：所选取菌、毒种必须在减毒性能和免疫原性之间到达平衡好大差小减毒活疫苗专题知识专家讲座第27页1.安全性②致癌性菌、毒种及代谢物质：不应有致癌作用;传代细胞系：在要求代次内使用，有效去除细胞DNA，残余DNA需达标;诱变及筛选菌/毒株：不用致癌性药品;载体疫苗：载体是无毒或减毒外源基因插入时，不应引发毒力返祖。减毒活疫苗专题知识专家讲座第28页2.良好免疫原性能促使机体产生：高效价保护性抗体黏膜免疫细胞介导免疫并含有良好免疫持久性减毒活疫苗专题知识专家讲座第29页3.遗传稳定性弱毒株起源？天然弱毒采取物理、化学和生物学方法将毒力较强菌毒株诱变为弱毒株只有选择突变遗传性能稳定菌毒株，才能最大程度地预防其使用过程中毒力返祖可能。减毒活疫苗专题知识专家讲座第30页4.生产适应性易于培养便于规模化生产有利于生产工艺流程可操作性和简化有利于确保产品产量和质量。减毒活疫苗专题知识专家讲座第31页二、减毒活疫苗制备技术要求

基本要求①设施与生产质量管理——中国《药品生产质量管理规范》②原、辅料:《中华人民共和国药典》、《中国生物制品主要原辅材料质控标准》③纯化水和注射用水：《中华人民共和国药典》④生产用器具:必须清洗洁净、灭菌处理。⑤生产及检定用动物:鸡胚细胞起源鸡群：SPF级提供肾脏家兔、狲猴：隔离检疫合格小鼠、地鼠、豚鼠：清洁级减毒活疫苗专题知识专家讲座第32页二、减毒活疫苗制备技术要求

2.菌、毒种国家药品管理局同意由国家药品检定机构或国家药品管理局所委托单位保留、检定及分发。减毒活疫苗专题知识专家讲座第33页二、减毒活疫苗制备技术要求

菌、毒种三级管理：定时全方面检定原始种子批应验明其统计、历史、起源和生物学特征。主种子批从原始种子批传出、扩增后冻干或深低温保留。工作种子批从主种子批制备，用于生产。主种子批和工作种子批在要求代次内生物学特征应与原始种子批一致减毒活疫苗专题知识专家讲座第34页3.细菌性减毒活疫苗制备技术要求

(1)培养基制备菌种用培养基疫苗生产用培养基检定用培养基等(2)菌种培养不一样细菌，要求不一样：培养基培养温度培养时间菌落形态、颜色等严格按照《中国生物制品规程》减毒活疫苗专题知识专家讲座第35页3.细菌性减毒活疫苗制备技术要求

(3)原液制备液体培养基：搜集菌膜，经洗涤、离心、压干等不一样处理步骤后，加

适量保护液制成所需浓度原液。固体培养基：将菌苔刮入保护液，或用保护液洗下菌苔制备原液。(4)分装、包装。

严格按照《中国生物制品规程》减毒活疫苗专题知识专家讲座第36页3.细菌性减毒活疫苗制备技术要求

(5)检定对菌种、原液、半成品和成品进行检定确保疫苗安全性和免疫原性等质量标准符合《中国生物制品规程》严格按照《中国生物制品规程》减毒活疫苗专题知识专家讲座第37页检定什么？①纯菌试验:生长物做涂片镜检，不得有杂菌。②噬菌体特异性试验:特异噬菌体应能完全裂解待检细菌，培养后应无细菌生长。③菌落、菌形检验:应含有经典菌落特征涂片镜检：培养经典形态特殊染色法：形态学判别减毒活疫苗专题知识专家讲座第38页检定内容④活菌数测定:一定温度、时间培后，单位体积活菌数必须在要求范围内。⑤浓度测定:按《中国细菌浊度标准》测定浓度。⑥毒力试验:一定量菌种培养物分别注射小白鼠或豚鼠，要求：试验动物存活体重增加减毒活疫苗专题知识专家讲座第39页检定内容⑦效力或免疫力试验:制备菌液，注射小鼠、豚鼠等试验动物普通免疫两次末次免疫后，用野型株进行攻击普通应保护50%~80%动物存活。各制品合格指标不一样，应按《规程》进行判定。减毒活疫苗专题知识专家讲座第40页4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求(1)生产细胞

适合用于病毒性疫苗生产/检定细胞有：二倍体细胞传代细胞原代细胞减毒活疫苗专题知识专家讲座第41页人二倍体细胞株起源:正常人胎肺或其它组织需进行全方面检定建立细胞株审批：《新生物制品审批方法》建株资料：所用胎儿胎龄和性别，终止妊娠原因;胎儿父母年纪、职业及健康情况，胎儿父及母系三代应无显著遗传缺点疾病历史;原始组织种类，原始细胞培养细胞数量与生长情况;细胞培养方法、历史、生长特征和寿命世代数;细胞生长液成份。减毒活疫苗专题知识专家讲座第42页人二倍体细胞株建株染色体检验：每8-12世代作一次最少应随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检验;最少选择50个分裂中期细胞进行显微摄影，做出核型分析;粗数500个分裂中期细胞，检验多倍体发生率;每次染色体检验标本片应长久保留，以备复查;细菌、真菌、支原体及病毒检验致肿瘤性检验减毒活疫苗专题知识专家讲座第43页②传代细胞系由人或动物肿瘤组织或正常组织传代转化而来，可悬浮培养或用载体培养，能大规模生产;可无限传代，但到一定代次后，致肿瘤性会增强，所以对生产用传代细胞系应进行严格检验。减毒活疫苗专题知识专家讲座第44页传代细胞系相关资料需得到国家药品监督管理局同意，并提供相关资料:细胞系起源，供者种属、年纪、性别和健康情况描述;细胞传代培养方法、生长特征、传代数，用于生产最高限制代数，所用生长液以及传代史等描述;初步确定可能存在外源因子检验结果;减毒活疫苗专题知识专家讲座第45页传代细胞系相关资料d.细胞系生长类型及形态学特征、细胞判别特殊标志、遗传特征(如HLA、DNA指纹图谱);e.提供细胞系用于预定目标资料;f.细胞系生产用限制代次和超出该代次10代以上生物学特征，要做出说明。减毒活疫苗专题知识专家讲座第46页③原代细胞起源：猴肾、鸡胚、地鼠肾、沙鼠肾、家兔肾、狗肾和鹌鹑胚，以及其它组织等。正常组织经消化后、进行细胞培养。只限于原始或少数几代(普通在5代)以内使用，以生物学性状不发生改变为标准。减毒活疫苗专题知识专家讲座第47页原代细胞使用注意事项在接种病毒或用于生产前，应进行外观和镜下检验，应无任何可疑、异常和病变。每批细胞培养留取5%-10%（最少留有500ml）悬液，不接种病毒，最少观察14天，并做细菌、真菌和支原体检验。减毒活疫苗专题知识专家讲座第48页原代细胞使用注意事项c.原代细胞起源动物必须健康，尽可能使用无特定病原体(SPF)动物d.对拟订用于生产动物种群，应定时检验有没有相关病毒抗体，应严格筛选。e.用于细胞制备动物剖检应正常，取留器官组织亦应正常，如有异常，不能用于制备细胞。减毒活疫苗专题知识专家讲座第49页4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求(2)生产细胞三级管理

①原始细胞库经过检定证实（适合于生物制品生产和检定）原始细胞群体，按一定量均匀分装于安瓿，于液氮或-100℃以下冻存备用。目标:每一生产周期，都能提供一个已标定好、相同质量细胞源。减毒活疫苗专题知识专家讲座第50页4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求(2)生产细胞三级管理

②主细胞库取原始细胞种子，经过细胞传代，增殖到一定数量，将全部细胞均匀混合成一批，定量分装于安瓶，于液氮或-100℃以下冻存备用。目标：主细胞库细胞经过全方面检定后，建立工作细胞库。减毒活疫苗专题知识专家讲座第51页4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求(2)生产细胞三级管理

③工作细胞库细胞由主细胞库传代扩增而来，冻存时细胞传代水平需确保细胞复苏后、传代增殖细胞数量能满足生产一批或一个亚批产品。传代水平必须在该细胞用于生产限制最高代次之内。减毒活疫苗专题知识专家讲座第52页4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求(2)生产细胞三级管理

④生产用细胞取冻存工作细胞库中一个或多个安瓶，混合后培养，传一定代次后供生产制品使用。传代次不得超出该细胞可用于生产最高限制代次。剩下生产用细胞，不再冻存和再用于生产。减毒活疫苗专题知识专家讲座第53页4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求(2)生产细胞三级管理

⑤体外培养细胞龄计算一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代依据每个细胞系实践经验数据，确定生产使用细胞最终限制代次生产用细胞龄限制在细胞寿命期限2/3以内。减毒活疫苗专题知识专家讲座第54页4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求生产程序

①细胞培养离体细胞病毒敏感谱广而易被病毒感染，可提供大面积微生物繁殖基质以确保产量。在生产过程中：不得使用青霉素或其它β-内酰胺类抗生素减毒活疫苗专题知识专家讲座第55页(3)生产程序②病毒培养将适量病毒接种到细胞中（感染复制数），在适当温度及时间内培养病毒致细胞病变(CPE）病毒脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒可参考CPE程度在培养限定时间内终止培养;不产生细胞病变病毒甲型肝炎病毒：在要求培养时间内终止培养。4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗专题知识专家讲座第56页(3)生产程序③病毒收获及释放经一定培养时间达病毒增殖高峰期，即应终止培养收获病毒；用研磨、冻融、超声波等处理以释放病毒。④半成品制备、糖丸加工、分装、包装按《规程》进行。减毒活疫苗专题知识专家讲座第57页(4)

检

定①病毒判别试验用一定量病毒特异性高价血清或有中和抗体特征单克隆抗体，与一定量病毒混合，置37℃中和一定时间后接种细胞培养，以最适温度培养一定时间后判定结果：病毒应完全被中和蚀斑法、病变法、ELISA法个别制品也用小鼠脑内接种来判定结果。减毒活疫苗专题知识专家讲座第58页病毒判别试验----蚀斑法病毒特异性高价血清有中和抗体特征单克隆抗体接种细胞病毒蚀斑细胞接种培养不产生蚀斑减毒活疫苗专题知识专家讲座第59页(4)

检

定②无菌试验按《生物制品无菌试验规程》进行。③病毒滴定样品作系列稀释，最少取3个稀释度分别接种细胞，在最适温度培养一定时间判定结果。蚀斑法、病变法或ELISA法以及动物试验减毒活疫苗专题知识专家讲座第60页(4)

检

定④外源因子检验病毒外源因子对照细胞外源因子每批生产用细胞应留取一定量作为对照细胞（不接种病毒），与接种病毒细胞用相同细胞维持液，在相同条件下培养后进行外源因子检验减毒活疫苗专题知识专家讲座第61页(4)

检

定⑤免疫原性检验用主种子批制成疫苗常规接种易感者检测抗体：免疫前和免疫后4-6周阳转率：不低于《规程》要求人数：普通不少于30人。个别制品：也能够小鼠免疫、攻击试验检验其免疫原性。减毒活疫苗专题知识专家讲座第62页(4)

检

定⑥

热稳定性试验疫苗成品在37℃放一定时间后，测其病毒滴度，其病毒滴度下降不得大于《规程》要求。减毒活疫苗专题知识专家讲座第63页第三节

减毒活疫苗

综合评价

减毒活疫苗专题知识专家讲座第64页一、减毒活疫苗优缺点

优点：①诱导体液免疫和细胞免疫两种免疫反应有制品：经过自然感染路径接种，还能够诱导出黏膜免疫，使机体取得较广泛免疫保护。②使用是活微生物，可在机体内长时间起作用、而诱导较强免疫反应。③活微生物有再增殖特征，理论上只需接种一次，即能够到达满意免疫效果。减毒活疫苗专题知识专家讲座第65页一、减毒活疫苗优缺点

优点：④可能引发水平传输，扩大免疫效果，增强群体免疫屏障；⑤无需添加佐剂；⑤生产工艺普通不需要浓缩纯化；⑦价格低廉。减毒活疫苗专题知识专家讲座第66页一、减毒活疫苗优缺点

缺点：①普通减毒活疫苗均保留一定残余毒力，对一些个体（如免疫缺点者）可能诱发严重疾病。②因为种种原因（如基因修饰等），减毒活疫苗有可能出现"毒力返祖"现象。③是活微生物制剂，可能造成环境污染、而引发交叉感染等。减毒活疫苗专题知识专家讲座第67页一、减毒活疫苗优缺点

缺点：④缺损颗粒可能干扰疫苗免疫效果。⑤产品分析评定较为困难。⑥保留、运输等条件要求较高，如需冷链等。减毒活疫苗专题知识专家讲座第68页二、减毒活疫苗使用策略评定

1.免疫程序

理论上:活微生物在体内再增殖特征：单剂免疫方案实际上：单剂免疫：往往达不到理想保护效果因为：传统减毒活疫苗往往减毒又减免疫原性新型疫苗（非复制型微生物载体疫苗等）所表示抗原量也往往偏低减毒活疫苗专题知识专家讲座第69页1.免疫程序

脊髓灰质炎减毒活疫苗（1960-）单价、双价、三价剂型1、2、3、4剂免疫方案当前方案：三价疫苗4剂免疫（1986）首次免疫：2月龄间隔4-6周：再连续免疫2次4岁：加强免疫1次。减毒活疫苗专题知识专家讲座第70页脊髓灰质炎减毒活疫苗不一样免疫程序比较三价疫苗单剂免疫三价疫苗4剂免疫抗体阳转率70%-90%95%-100%中和抗体水平++++++++本疫苗已使我国本土毁灭了由野型株引发脊髓灰质炎减毒活疫苗专题知识专家讲座第71页甲型肝炎减毒活疫苗免疫效果比较:诱导抗体反应与剂量正相关两针免疫接种方案：受到日益广泛重视和研讨。第一针免疫后4-8周加强免疫抗体阳转率80%-100%95%-100%抗体滴度偏低提升抗体连续时间延长减毒活疫苗专题知识专家讲座第72页1.免疫程序应依据对疫苗保护效果及其持久性要求来制订并完善减毒活疫苗专题知识专家讲座第73页2.免疫路径

自然感染：绝大部分病原体经过黏膜入侵机体减毒活疫苗免疫接种：大多数采取非肠道路径(如皮下注射、皮上划痕)减毒活疫苗专题知识专家讲座第74页非肠道路径免疫接种路径缺点免疫诱导位点不定向产生免疫反应仅为系统免疫、缺乏局部应答;免疫接种人员需要培训，需使用接种器材，不但造成给药成本较高，且有潜在交叉污染可能;接种时引发局部疼痛以及其后局部反应往往不易被免疫对象所接收减毒活疫苗专题知识专家讲座第75页自然感染路径免疫接种脊髓灰质炎减毒活疫苗（口服）取得了非常成功个体和群体免疫保护效果。黏膜路径免疫：受到日益重视和深入研究消化道呼吸道泌尿生殖道黏膜某处受抗原刺激免疫活性细胞会在其它黏膜部位产生对应特异免疫反应减毒活疫苗专题知识专家讲座第76页黏膜免疫优势:①发挥黏膜第一屏障作用，阻止病原体入侵甚至在局部去除;②诱导包含局部和系统应答在内全方面免疫保护效果;③免疫方便，副反应小，安全性好，易被免疫对象接收;④给药成本低，疫苗制备成本也低。减毒活疫苗专