克氏螯虾壳聚糖的荧光标记及其抗菌活性研究

克氏螯虾壳聚糖的荧光标记及其抗菌活性研究

1碱性氨基多糖克氏合金提取糖是作者从克氏合金的外壳中提取并制造的一种碱性氨基糖，p。22.12.1.1克氏合金虾皮由作者自己从克氏螯虾的外壳中提取制备2.1.2研磨光刻5(6)-羧-四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺[5(6)-TAMRA-5-maleimide],(Biotium公司)。2.1.3试验消毒大肠埃希菌(ATCC25922)及金黄色葡萄球菌(ATCC25923)质控菌株,由江苏大学附属人民医院提供。2.1.4其他试剂液体培养基所包括的蛋白栋、酵母提取物及琼脂等成分,购于Oxoid公司;其余试剂均为分析纯级别。2.2超速离心机LSM510激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司),Centrifuge54172超速离心机(德国Eppendoff公司)。2.32.3.1不同混合的壳聚糖溶液制备mt为观察不同比例壳聚糖与游离荧光混合对壳聚糖抗菌性能的影响,取10.0g/L克氏螯虾壳聚糖溶液与游离荧光试剂5(6)-TAMRA-5-maleimide分别按1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1混合,4℃过夜,向标记好的壳聚糖溶液分别加1mol/L氢氧化钠,析出沉淀,倒去上清,留沉淀,并用乙酸-乙酸钠冲洗,再向上清液中加氢氧化钠析出沉淀,如此反复至无沉淀出现为止。将洗净的沉淀烘干,得5种荧光标记克氏螯虾壳聚糖。2.3.2克氏螯虾壳聚糖溶液配制取一定量上述烘干的5种荧光标记克氏螯虾壳聚糖依次溶于1%(v/v)醋酸,得浓度为10.0g/L溶液,再用二倍稀释法制成5.0g/L、2.5g/L、1.25g/L的溶液,并用1mol/L氢氧化钠把各浓度荧光标记克氏螯虾壳聚糖溶液及1%醋酸的pH调节到5.8。2.3.3克氏螯虾壳聚糖的荧光标记准备一系列装有0.9ml液体培养基(pH6.0)的试管,分别加入0.1ml上述5种荧光标记克氏螯虾壳聚糖的不同溶度溶液,使各种荧光标记克氏螯虾壳聚糖终浓度依次为1.0g/L、0.5g/L、0.25g/L、0.125g/L,另设游离荧光对照、1%醋酸对照管,各管pH都为5.9。将生长良好的试验菌加到各管中,使菌落浓度为10未标记荧光的克氏螯虾壳聚糖的抗菌活性检测用1%醋酸及一系列浓度的克氏螯虾壳聚糖,按照上述方法对两种试验菌进行抗菌试验。2.3.4激光联合成像选择一个留有抗菌活性的荧光标记克氏螯虾壳聚糖(10g/L),与浓度为1033.1荧光标记克氏螯虾壳聚糖病菌种游离荧光对照及醋酸对照管中均有明显细菌生长。从表1看出,未标记荧光的克氏螯虾壳聚糖对两种试验菌的MIC均为0.25g/L、MBC均为0.5g/L;1∶1、3∶1、5∶1三种荧光标记克氏螯虾壳聚糖管内大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌都明显生长,说明抗菌活性丢失;7∶1虽然有抗菌活性,但已丢失大部分活性;9∶1的MIC均为0.5g/L、MBC均为1g/L,仍具有50%的抗菌活性,因此选定9∶1荧光标记克氏螯虾壳聚糖做下一步试验。3.2荧光显微镜检测荧光标记克氏螯虾壳聚糖试验组和游离荧光对照组分别与两种试验菌作用8h后,对照组在荧光显微镜下无法观测到荧光;试验组其两种试验菌由表及里的荧光强度逐渐增强(图1),说明荧光标记克氏螯虾壳聚糖已进入细菌的内部。4荧光标记克氏螯虾壳聚糖荧光试剂5(6)-TAMRA-5-maleimide是罗丹明类标准荧光素的衍生物,具有很强的光稳定性及荧光产量,pH敏感性低,其活性基团可以通过与对方大分子结构上的氨基结合形成荧光标记物克氏螯虾壳聚糖分子上存在有游离氨基综上所述,控制荧光