水质监测中叶绿素a提取方法的改进

水质监测中叶绿素a提取方法的改进

常绿叶子是水体最重要的生产力指标。通过测定生活方式，我们可以了解水体的生产力和富营养化水平。这是水质监测的传统项目。因此，有必要通过简单实用的方法来确定叶片a的含义。浮游植物叶绿素的测定方法有分光光度法在实际操作中,人们已认识到丙酮-研磨法存在的缺点,并从多方面进行了改进,主要从提取液、提取方式、提取温度和提取时间等方面改进1材料和方法1.1材料表面2种水样分别取自暨南大学明湖湖水和实验室内培养的纯微囊藻液。1.2水样的预处理实验分为两部分:1)研磨法和反复冻融-浸提法提取叶绿素a的比较,这部分所用滤膜为醋酸纤维滤膜;2)采用反复冻融-浸提法比较实验室常用的3种滤膜(醋酸纤维滤膜、微孔滤膜和GF/F玻璃纤维滤膜)对结果的影响。由于2种水样叶绿素a浓度较高,为了保证取样的准确,对水样稀释了10倍后再过滤4个体积,分别为50mL、100mL、500mL、1000mL,并设置3个平行。水样的采集、过滤浓缩、滤膜的保存、提取液的离心以及叶绿素a的测定计算方法均参照《水生生物监测手册》。研磨法为监测手册里的标准方法,步骤为:将滤膜剪碎,放入研钵,加入少许碳酸镁、石英砂和10mL浓度为90%的丙酮研磨(6mL左右研磨,其余润洗),将样品转入离心管,振摇使样品分布混匀,于4℃冰箱浸提8～20h。反复冻融-浸提法是本实验改进的方法,即将过滤水样后的滤膜装进黑色塑料袋,于-20℃冰箱和室温下反复冻融3～5次,再放进盛有10mL丙酮(90%)的离心管中振摇一分钟后,于4℃冰箱浸提20h,浸提过程中需振摇1～2次。2结果和分析2.1反复冻融-浸提法与反复冻融-浸提法的比较研磨法和反复冻融-浸提法对叶绿素a的提取原理不同,前者主要通过机械作用破坏藻类的细胞壁和叶绿体使叶绿素a溶解于丙酮。反复冻融-浸提法对藻类叶绿素的提取通过两方面来完成,一是滤膜在-20℃下冰冻,再在室温条件下融解,利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度的增高引起溶涨从图1可看出,采用反复冻融-浸提法所测得的叶绿素a水平均明显高于研磨法,两者之间存在着显著的差异。且研磨法平行样的标准偏差较大,这主要受人为因素影响,浸提法减少了研磨和转移过程中叶绿素a的损耗,人为误差小,稳定性好。与浸提所测结果的平均值作比较,湖水水样研磨所造成的损耗率在2.5～31.1%之间,平均值为23.4%,微囊藻液在15.2～39.5%之间,平均值为26.1%。2.2种滤膜的选择性对比结果见图2,方差分析表明滤膜对结果影响不显著。因此在反复冻融-浸提法中对这三种滤膜可以进行自由选择。本实验所比较的三种滤膜为应用比较广泛的醋酸纤维滤膜、微孔滤膜和玻璃纤维滤膜(GF/F),醋酸纤维滤膜和微孔滤膜能部分融解于丙酮中,玻璃纤维滤膜则不融解。2.3净化水体中叶绿素a含量的检测结合图1和图2的结果分析过滤水量对结果的影响。从浸提法的结果来看,过滤水量对2个水样测定结果的影响不同。方差分析表湖水水样叶绿素a所测值存在极显著差异(P<0.01),而纯藻液结果差异不显著(P>0.05)。表明在直接测定自然环境的水样时不同过滤水量对结果有一定的影响,而对单藻的测定影响不明显。湖水水样中浮游植物种类主要有蓝藻门的微囊藻(Microcystisspp)、平裂藻(Merismopediasp.),绿藻门的栅藻(Scenedesmusspp)、月牙藻(Selenastrumspp)和硅藻门的脆杆藻(Fragilariasp.)、针杆藻(Synedrasp.)。蓝藻细胞体积小细胞壁薄,硅藻细胞壁相对来说较为坚硬。细胞壁结构的差异造成反复冻融过程中各门藻细胞的破壁率不同,不同藻细胞内叶绿素a含量也不同,因此对同一水体来说叶绿素a的提取效率受过滤水量的影响。从图1和图2均可以看到湖水水样过滤50mL和100mL所测结果明显高于过滤500mL和1000mL所测得的值,但平行间的标准偏差相对来说也较大。在663nm处的吸光值太低容易造成偏差,太高则会降低浸提的提取效率。根据本实验的结果,将663nm处的吸光值控制在0.02～0.10范围内较好。对寡营养水体、中营养水体和富营养水体,建议较适合的过滤水量分别为500mL～1000mL、200mL～500mL和50mL～100mL。纯藻液由于细胞间差异小,且破壁率与细胞密度没有明显关系研磨法对藻类细胞壁的破坏程度较高,受种类组成差异的影响小,其结果主要由研磨和转移过程造成叶绿素a的损耗来决定,与过滤水量的大小没有直接关系。3讨论3.1影响时间的因素已报道的改进方法主要从提取方式、提取液、提取温度和提取时间等方面考虑。提取方式的改进采用直接浸提本文提出的反复冻融-浸提法在操作上比上述改进方法简单,不用水浴升温、超声波振荡,不存在高温条件下叶绿素a被破坏3.2滤膜的融解时间由于反复冻融法是利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度的增高引起溶涨来达到破碎细胞壁的目的,因此抽滤后的滤膜应保留少许水份。由于滤膜上的水份含量较少,滤膜的冰冻和融解时间不需太长,一次冻与融的时间比例大概为20min/5min,冰冻时间可以延长,融解时间最好不超过10分钟,滤膜变软即可。在反复冻融和浸提过程中必需严格避光,可将样品置于黑色塑料袋。叶绿素a的降解可分为暗降解和光降解,张武昌研究了光和温度对叶绿素a降解的影响还要注意水样在过滤浓缩过程中应加碳酸镁悬浊液。叶绿素a分子酸化失去镁原子转变成脱镁叶绿素a,酸化前后的样品在665nm的读数比值约为1.74过滤水量的确定反复冻融-浸提法跟研磨法比较,具有人为误差小稳定性好、结果准确且操作简单安全等优点,跟已报道的改进方法对比,在操作上也具有简单方便的特点,适合运用到常规的水质监测。采用该方法时过滤水量的大小对湖水水样的测定结果有一定的影响(P<0.01),对于纯藻液影响不明显(P>0.05)。这是由于湖水水样中的浮游植物种类组成复杂,不同藻的叶绿素提取效率