发状念珠藻细胞破碎方法的研究

发状念珠藻细胞破碎方法的研究

蓝藻是红藻和绿藻中独特的捕光性蛋白。这是一种重要的内源性碳硅蛋白。发状念珠藻(Nostocflagelliforme)是一种生长于荒漠-半荒漠地区的陆生蓝细菌1材料和方法1.1材料表面野生发状念珠藻及液态培养发状念珠藻细胞由天津市工业微生物重点实验室保藏。1.2方法1.2.1细胞破碎方法的确定将野生发状念珠藻洗净晾干后研磨成粉,4℃保存备用。将液态培养发状念珠藻细胞培养液5000r/min离心15min,收集细胞冷冻干燥,研磨得到细胞粉,作为各种破碎方法的待测样。1.2.2细胞破碎法液氮研磨法:称取野生或液态培养发状念珠细胞粉置于研钵中,加入液氮研磨。反复冻融法超声波破碎法高压均质法玻璃珠法1.2.3蛋白总量/初始细胞密度g/l破碎率测定方法蛋白释放量(R)=上清液中可溶蛋白总量(g/L)/初始细胞密度(g/L)。细胞破碎率=R/R藻蓝蛋白提取得率(D)藻蓝蛋白纯度用A可溶性总蛋白测定:Bradford法2结果与分析2.1细胞密度对破碎率的影响液氮研磨不易破坏研磨物组织成分,同时增加其脆性易于磨碎。液氮研磨时,由于复水后的发状念珠藻样品易结冰,不利于研磨破碎,故直接采用干粉。对于发状念珠藻而言,破碎效果并不理想,破碎率均低于30%(表1)。随着细胞密度的增大,发状念珠藻细胞破碎率有所下降,相应的藻蓝蛋白的提得取率也依次递减。但是液态培养较野生的发状念珠藻的藻蓝蛋白的提取纯度高出接近3倍(0.471/0.161)。2.2细胞破碎带的推动容器中添加一定量的玻璃珠模拟磨珠机的工作原理是圆盘的高速旋转可使细胞悬浮液和珠子相互搅动,从而通过剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而使细胞破裂2.3藻细胞破碎率低在室温和-20℃条件下,对发状念珠藻细胞进行反复冻融处理,表3结果表明野生发状念珠藻细胞破碎率仅为11.1%。可能是野生发状念珠藻胞外有胶质鞘包裹,影响了细胞的破碎率,以及藻蓝蛋白提取得率与纯度。相对应液态培养发状念珠藻细胞破碎为18.73%,多次冻融能增大细胞壁的通透性,能将胞内藻蓝蛋白水溶出来,提高了藻藻蓝蛋白的提取得率和纯度。2.4分离培养发状念珠藻破碎率如表4,采用超声破碎发状念珠藻细胞,野生发状念珠藻细胞破碎率为21.11%,液态培养发状念珠藻破碎率达到70.27%,后者明显高于前者。野生发状念珠藻细胞向细胞外分泌胶质物质,将藻丝体包裹,形成胶质鞘,对细胞起到保护作用2.5材料破碎方法对材料的细胞破碎率的影响高压均质能使细胞在一系列过程中产生高速碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎。野生发状念珠藻呈发丝状,不同于一般的蓝细菌,在采用其他破碎方法时,只能将其从念珠状藻丝打碎成球状细胞,并不能将其细胞壁完全破碎。如表5,采用高压均质能使细胞通过物理机械的作用均匀地挤压破碎,释放其内溶物,破碎率达到96.45%。液态培养发状念珠藻破碎率则达到97.06%,均取得很好的破碎效果。同时野生和液态培养发状念珠藻藻蓝蛋白的提取得率明显高于其他破碎方法,分别达到了1.43%和1.31%。但是,由于高压均质破碎能使胞内物充分溶出,故提取得到的藻蓝蛋白的纯度并不是很高。3细胞破碎方法的选择粗提掖中藻蓝蛋白浓度的测定3.1采用五种细胞破碎方法破碎野生和液态培养发状念珠藻细胞,两者有明显的区别。结果表明,液态培养发状念珠藻细胞的破碎率均高于野生发状念珠藻细胞。两者的破碎效果最佳方法都为高压均质破碎法。3.2采用高压均质处理野生发状念珠藻细胞,藻蓝蛋白的提取得率明显其他几种方法,纯度较高,是野生