叶绿体色素提取和分离实验的改进

叶绿体色素提取和分离实验的改进

“提取和分离叶绿化剂”实验是在高等教育的三个专业生化系的“植物生物化学”课程中进行的一个实验。这也是高中生物实验中最困难的一个。该实验的目的在于验证叶绿体色素的种类及性质、叶绿体色素在植物光合作用中的作用,加深对光合作用相关内容的理解。但在实验中,常因实验材料中色素含量低、提取制备较难、层析分离后色带清晰度差、甚至色带种类不全等诸多因素,最后影响了实验结果。作为师范院校的学生必须把这个实验的原理、方法、难点理解透彻,为将来从事教学打下坚实的基础。笔者在讲解实验原理及操作的过程中紧紧抓住几个为什么,同时针对实验成败关键之处,如叶绿体色素的提取、过滤与点样,根据多年的实践,并参考有关的资料进行一些改进,取得了很好的实验教学效果。1.种色索分离原理叶绿体色素分离的实验原理是:叶绿体中的色素在层析液中的溶解度不同,溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快;溶解度低的随层析液在滤纸上扩散得慢。这样几分之后,叶绿体中的色素就在扩散过程中分离开来。其中胡萝卜素在丙酮中的溶解度最高,扩散速度最快,叶黄素和叶绿素a次之,叶绿素b溶解度最低,扩散得最慢。由此原理推断,得到色素分离的滤纸图应为:胡萝卜素的溶解度最大,其在层析液中的含量最多,所以在色素带分离中形成的色素带幅度应最高、最宽,叶黄素和叶绿素a次之,叶绿素b的溶解度最低,在层析液中的含量最少,在色素带分离中形成的色素带应最低、最窄。但实验结果得到的图形却是:扩散最快且位置最高的是胡萝卜素,其含量最低,色素带幅度最窄;而最慢的叶绿素b的色素带次宽,显示其含量次多;次慢的叶绿素a的色素带最宽,显示其含量最高。是什么原因造成这种差异呢?实际上单以色素在层析液中的溶解度高低来解释色素的分离是行不通的,还需要从色素的分子结构、分子量方面去解释,即色索分离的原理,四种色素在层析液中的含量不同,因分子量大小的不同、分子极性的不同,而随层析液在滤纸上的扩散速度不同,其中胡萝卜素的分子量最小,极性最弱,含量最少,扩散速度最快,色素带幅度最窄,叶黄素次之,叶绿素b的分子量最大,极性最强,扩散速度最慢。叶绿素a因其单位叶片量中的含量最多而色素带带幅最宽。2.实验中的一些原因只要我们理解了实验中的几个为什么,就抓住了这个实验设计的整个核心,真正弄懂了本次实验。2.1.体色素和丙酮为有机溶剂研磨时加入丙酮,起到提取色素的作用。因为叶绿体色素是脂溶性的,易溶于有机溶剂,而丙酮是有机溶剂。丙酮之所以能提取出色素,是由于丙酮分子能通过范德华力与色素分子相互吸引而溶解色素。2.2.研磨研磨目在提取色素研磨时,要加入少许石英砂,其目的是为了使研磨更充分。实际上石英砂就是二氧化硅,研磨时可以增大强度,加快细胞和叶绿体中的色素释放。2.3.中和细胞液的酸性在提取色素研磨的过程中加入少许碳酸钙是为了防止在研磨时叶绿体中的色素受到破坏。实际上,叶绿体中的色素所处的环境具有微碱性。实验中由于研磨会使细胞结构遭到破坏,细胞液(具有微酸性)流出,酸性的细胞液就会直接与叶绿体中的色素接触,致使叶绿素的分子结构遭到破坏,这是因为叶绿素是一种含镁的化合物,其中的镁易被氢离子、二价铜离子、锌离子等取代。形成去镁叶绿素,使叶绿素失镁,呈黄褐色。而碳酸钙是强碱弱酸盐,碳酸钙在水中的溶解度很小,但还是能溶解,呈现一种弱碱性,中和了细胞液的酸性,保护了叶绿体的色素。如果我们把不加碳酸钙的色素提取液和相同条件加碳酸钙的色素提取液加塞后放在暗处放置几小时,前者变黄而后者无显著变化,说明前者叶绿体色素容易遭到破坏,证明碳酸钙的确能够防止色素的破坏。2.4.滤纸条的形态转化若不剪去滤纸条的两角,色素带的两边和中间不是在一条直线上。这是由于位于滤纸条两边的溶剂分子可以向三个方向散失,色素向上“跑”的速度较快。而滤纸条中间的溶剂分子只能有两个方向散失,分别是向内和向外,因而色素会“跑”的较慢。而现在剪去滤纸条的两个角,可以在一定程度上加快中间色素的扩散速度,减慢两边色素的扩散速度,从而在实验中获得比较理想的色素带。在层析中加入少许无水硫酸钠的原因在于无水硫酸钠起着干燥剂的作用,对色素提取液进行吸水处理,使提取液浓度提高,使实验效果更为明显。加入无水硫酸钠的另一作用是增大层析液的极性、延缓层析分离速度。3.对实验方法的改良通过查阅文献资料,再参考笔者多年的实践经验,针对实验成败的关键之处,如实验材料的选择、提取液色素含量的高低、色素提取的难易、点样是否均匀、层析剂等,对实验方法进行改良3.1.柱层析分离法叶绿体色素分离提取方法有纸层析法、溶液分离法和柱层析分离法。纸层析法中四种色素能清晰分辨;溶液分离法胡萝卜素不易分辨;柱层析分离法叶绿素a、b明显,叶黄素较浅。我们采用纸层析法。其分离装置如下图所示:其中的滤纸条长度应与烧杯相应,而泡沫塞是用小刀将泡沫切成与木板盖上的圆孔大小相应,且用钢锯条在其下端中央锯一条缝,深度为泡沫塞的3.2.上有绿化的植物叶片关于实验材料,有关教材或实验指导书中大多选用的是菠菜,但菠菜有季节性限制。通过笔者多年的比较研究,发现实际上有很多植物的叶片均可作为实验材料,但植物叶片必须是鲜绿的,且不宜是革质或蜡质的,也就是机械组织、纤维素较少、叶绿素含量高的种类。有的文章报道采用油菜、芹菜、菊花,我们实验室采用的是菠菜,只不过我们要把菠菜放在45的烘箱里烘40多分钟,使菠菜的水分失掉一半为宜,放置冷却,这样就减少了菠菜的含水量,利于色素的分离和提取。3.3.丙酮研磨法常用的提取液为丙酮,书上要求加入量为15毫升,此量太大,容易造成提取液浓度太低,在实验中我们只加入6-8毫升的丙酮,分三次加入:首先在研磨中加入2毫升丙酮,迅速而充分地研磨,研成黄绿色浆后;再加入2毫升丙酮,继续稍缓研磨,直到出现少量蓝绿色液体。将研磨液倒入漏斗过滤之;最后用2毫升丙酮冲洗研钵和研臼,冲洗液也可倒入漏斗。在以上过程中,丙酮分三次加入,既可减少丙酮用量,又有利于叶绿体色素充分溶解于丙酮。在研磨的过程中我们可以加入少量的氯化钠,因氯化钠是强电解质,其原理在于:盐在水中电离成离子,这些离子的半径较小,而且带有正负电荷,和水的亲合力大于有机分子与水的亲合力,故盐对水分子的吸引力大于水分子和有机溶剂分子之间氢键的力量,所以能把水和有机溶剂分开。3.4.滤液浓度不一形成带谷传统的滤纸条点样方法是用细毛细管进行点样,但由于操作者的操作水平,而造成划线不是很细、点样不是很均匀,造成滤液细线上的浓度不一,从而影响色带形状:高处形成一个峰,低处形成带谷。其主要原因是滤液细线上的浓度不一,浓度大处,色素溶解慢,随层析液上升一段距离后再分离,色素分离晚,形成带峰;浓度低处分离早,形成带谷。针对这种方法的不足,我们经过摸索,觉得用以下方法实验效果比较好:用烘干的滤纸条沿着去角一端的梯形长底边(距滤纸条顶端的1-1.5厘米处)对折轻压,然后用折缝轻蘸一下培养皿中