马立克氏病病毒mirna缺失株的构建及生物学特性研究

马立克氏病病毒mirna缺失株的构建及生物学特性研究

马丽康病毒（mdv）是致肿瘤性最严重的流行病毒之一，可导致以恶t淋巴细胞增生为特征的马丽康病（md）。MD传播速度快、传播范围广、潜伏期长，在全世界养禽国家均有流行，每年都给养禽业造成了巨大的经济损失。在已经被预测到的MDV的140多个阅读框架（RLORF）中，Meq基因一直被认为是主要的致瘤基因本研究为了验证MDV-1编码的miRNA与MDV致瘤性的关系，以带有β-半乳糖苷酶（LacZ）报告基因的重组MDV毒株rMS△Meq为亲本病毒，通过同源重组反向筛选的方法，对MDV-1的Meq基因上游部分miRNA进行敲除，构建重组病毒rMS△miR9-12。重组病毒rMS△miR9-12的构建为研究MDV致瘤机制和基因功能提供了一个新的平台。1材料和方法1试验病毒的分离MDV-1型MS株，为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所马立克研究组于2007年2月从四川省眉山地区分离的流行毒株。亲本病毒rMS△Meq株为本试验在MS株基础上敲除了Meq基因并插入LacZ报告基因后构建的重组MDV。无特定病原体（SPF）鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。1.2细菌和气体大肠杆菌（E．coli）DH5α化学感受态细胞购自哈尔滨赛拓生物公司。商品化的pUC19载体购自大连宝生物工程有限公司。1试剂和试剂盒ExTaqDNA聚合酶，限制性内切酶SacⅠ、XbaⅠ和HindⅢ，T4DNA连接酶，蛋白酶K，DL2000DNAMarker、DL15000DNAMarker和M199、小牛血清等均购自大连宝生物工程有限公司；蛋白胨、酵母提取物为OXOID公司生产；琼脂糖、Tris购自Promega公司；DNA小量胶回收试剂盒购自北京康为世纪有限公司；小量质粒提取试剂盒购自美国OMEGA公司；其他试剂为国产或进口分析纯。1相关基因序列的构建参考GenBank中登录的MDV超强毒Md5株的相关基因序列，采用Oligo6．0软件设计了5对引物（见表1），用于构建同源臂和重组病毒的鉴定，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。15.病毒转移样本的质量粒的构建取9～10日龄的SPF鸡胚，按文献1.6病毒的共转染和纯度根据文献1总dna的提取将纯化的重组病毒接种原代CEF，待蚀斑生长至70%时收获细胞，用Tiangen公司的基因组DNA提取试剂盒提取重组病毒的总DNA；以提取的重组病毒的总DNA为模板，用引物P3和P5进行PCR鉴定。再以引物P4进行PCR扩增，将产物连接到pMD18-T载体上，菌液送北京六合华大基因科技有限公司测序做进一步鉴定，将测序鉴定纯化的病毒命名为rMS△miR9-12。1体外生长特性在相同的生长条件下，在显微镜下观察亲本病毒rMS△Meq株和重组病毒株rMS△miR9-12的体外生长特性，主要观察蚀斑大小、折光性、形状和形态的变化情况。将纯化后的重组病毒rMS△miR9-12在CEF上连续传20代，提取第10和第20代病毒的DNA，用引物P3和P5进行PCR检测。1．4重组病毒的检测绘制纯化后病毒的生长曲线，具体步骤如下：将MS毒株和重组病毒rMS△miR9-12以3%的细胞培养液稀释成100蚀斑形成单位（PFU）/mL，以每孔1mL的剂量接种已铺成单层的CEF原代细胞的6孔板，待病毒生长1、2、3、4、5、6、7d后，用胰酶消化病毒，收集每种病毒，每天3个重复孔，用Tiangen公司的基因组DNA提取试剂盒提取重组病毒的总DNA，以双重实时荧光定量PCR方法测定每百万细胞病毒的拷贝数（copies/102结果与分析2阳性质粒的鉴定重组质粒pUCAB通过引物P1和P2进行PCR扩增，分别得到约900bp的A片段和2700bp的B片段（见图1），PCR鉴定结果显示，该质粒为阳性质粒。将PCR鉴定为阳性的质粒通过HindⅢ单酶切得到6300bp左右的片段，同时通过XbaⅠ+HindⅢ双酶切得到约2700bp和3500bp的片段（见图2），与预期结果一致。测序结果也显示该质粒为阳性质粒。2病毒转移载体质粒通过调节转染用核酸及休克时间等条件，发现用10μg核酸和2μg的重组病毒转移载体质粒通过90s的休克时间获得的转染效率最高。待蚀斑出现后，用Bulo-Gal染色4h以上，挑取单个白斑病毒，进行5轮蚀斑纯化，最终形成的蚀斑用Bulo-Gal染色后在显微镜下观察无蓝斑，全部显白色。2mir-m12基因缺失重组病毒rMS△miR9-12用引物P3进行鉴定，亲本毒株rMS△Meq扩增的片段大小为2000bp左右，重组病毒rMS△miR9-12扩增的片段大小约为900bp，与预期结果一致（见图3），证明了MDV1-miR-M9至MDV1-miR-M12编码的基因已经缺失。用引物P5鉴定，重组病毒rMS△miR9-12不能扩增出结果，亲本病毒rMS△Meq扩增出1400bp左右的条带，与预期结果一致（见图4）。证明重组病毒rMS△miR9-12的LacZ基因已经被替换。以NCBI中登录的Md5株基因序列为参考，设计引物P4，对重组病毒rMS△miR9-12（132459-136365）进行PCR扩增，并将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序，测序结果示意图见图5。结果显示，编码MDV1-miR-M9、MDV1-miR-M5和MDV1-miR-M12（132909-134089）的基因已缺失，将重组病毒rMS△miR9-12的Meq序列（134867-135886）与MS低代次强毒株的Meq序列进行比对，结果二者完全一致。2形态和蚀斑大小在相同的生长条件下，rMS-△Meq株和rMS-△miR9-12株在体外的蚀斑大小、折光性和形态均无明显变化。PCR检测第10代、第20代rMS-△miR9-12株，证明病毒的MDV1-miR-M9至MDV1-miR-M12编码的基因已缺失，表明遗传性稳定。2．3重组病毒鉴定采用双重荧光定量PCR方法测定每天每百万感染细胞中的病毒拷贝数，对其平均值取lg值，绘制重组病毒rMS△miR9-12和MS毒株的生长曲线（见图6）。结果表明，重组病毒rMS△miR9-12比MS毒株生长速度快，因为构建重组病毒的亲本毒株rMS△Meq比MS毒株的代次高。重组病毒rMS△miR9-12和MS毒株在第5天均已进入平台期。3．3重组病毒的构建MDV是一种可以诱导禽类产生肿瘤性疾病的病毒，多年来人们尚不完全了解它的致瘤机制。Meq基因与Jun/fos肿瘤基因家族具有相同的结构域，一直以来被认为是MDV的主要致瘤基因目前人们对MDV编码miRNA与致瘤机制关系的研究仅仅停留在检测它的表达量与组织肿瘤关系的初始阶段，为了进一步证实二者之间的关系，本试验决定构建缺失部分miRNA的重组MDV。本试验以带有LacZ报告基因的rMS△Meq株为亲本病毒，利用同源重组反向筛选的方法，对位于Meq基因上游第1簇miRNA进行部分基因敲除，构建了重组病毒rMS△miR9-12。此重组病毒的成功构建主要因为正确选择了亲本毒株和缺失部位，选择rMS△Meq株为亲本病毒有2个原因，一方面是为同源重组反向筛选的方法奠定基础，简化病毒筛选工作的难度；另一方面是因为亲本病毒rMS△Meq是在MS株基础上缺失Meq基因后构建成功的，MS株是MDV流行毒株，该毒株具有致病性高、体内增殖能力强等特点选择编码MDV1-miR-M9、MDV1-miR-M5和MDV1-miR-M12的基因片段进行缺失是为了避免干扰性的重组失败。因为Meq基因上游的第1簇miRNA中的MDV1-miR-M2、MDV1-miR-M4和部分MDV1-miR-M3镶嵌于RLORF8中，而RL-ORF8是否是必需基因笔者又不可知，如果选择整个第1簇miRNA进行缺失，就有可能因为RLORF8是必需基因而导致重组失败。本试验在选择缺失部位的时候避开RLORF8，只缺失第1簇miRNA除去RLORF8外的其余miRNA，避免了这种失败。另外，MDV编码的miRNA是簇生排列，它们所编码的基因