食品微生物分离、纯化技术 课件

食品微生物技术——食品学院适合专业（群）：食品加工技术专业群教师：万国福壹贰菌种分离、纯化微生物生长项目五食品微生物分离、纯化技术知识领域任务一微生物生长、菌种保藏认知叁菌种保藏行动领域任务二混合菌种分离、纯化5.1微生物生长知识领域任务一微生物生长、诱变育种及菌种保藏认知生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。生长：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。繁殖：生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长一、微生物生长群体生长=个体生长+个体繁殖个体生长→个体繁殖→群体生长在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）微生物生长:在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。单位时间里微生物数量或生物量的变化微生物生长：微生物生长的测定：个体计数群体重量测定群体生理指标测定评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；二、微生物生长量的测定（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）1、培养平板计数法二、微生物生长量的测定采用培养平板计数法要求操作熟练准确，否则难以得到正确的结果：样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复,取平均值；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定（参见P109）采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；4、显微镜直接计数法（二）以生物量为指标测定微生物的生长1、重量法以干重直接衡量微生物群体的生物量；通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法（二）以生物量为指标测定微生物的生长2、比浊法在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(O.D.)表示菌量。实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。微生物的特点：个体微小肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个单个的微生物组成的群体。微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础三、细菌的个体生长和同步生长

同步培养技术：设法群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所产生的变化。同步生长方法：1、环境条件诱导2、物理方法从随机的、不同步细菌群体选择出同步的群体同步培养：

使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。

以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长。同步生长：通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。机械方法离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法环境条件控制技术温度培养基成份控制其他（光照和黑暗交替培养）第二节细菌的群体生长繁殖硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。1、生长曲线生长曲线(GrowthCurve)：

细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。四、微生物生长曲线细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图一条典型的生长曲线可以分为迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期迟缓期(Lagphase)：将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。迟缓期的特点分裂迟缓、代谢活跃

细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。迟缓期出现的原因微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。调整代谢迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；(2)利用对数生长期的细胞作为种子；(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；(4)适当扩大接种量对数生长期(Logphase)：以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。

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–t00.639G=——————=—————

nmm：比生长速率在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generationtime)，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doublingtime)。代时通常以G表示。影响微生物增代时间（代时）的因素：1）菌种，不同的微生物或菌株的不同代时也不同2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短3）营养物浓度，生长速率与营养物浓度呈正比凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。4）温度，生长速率与培养温度呈正相关稳定生长期(Stationaryphase)由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。细胞重要的分化调节阶段；储存糖原等细胞质内含物，芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等。也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。生产上常通过补充营养物质（补料）或取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡等措施延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。衰亡期(Decline或Deathphase)营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NH4+等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成二次生长现象。由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获分批培养（batchculture）封闭培养（closedculture）特点：培养基一次加入，不予补充，不再更换连续培养(Continousculture）在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。特点：培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。五、微生物的连续培养控制连续培养的方法恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定恒化连续培养保持恒定的流速（一）恒浊连续培养测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出的流速使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的生长速率。（一）恒浊连续培养一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业（连续发酵）连续发酵与单批发酵相比的优点：缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定。缺点：杂菌污染和菌种退化（二）恒化连续培养使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其他营养物均过量。（细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度，并低于最高生长速率）限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，如氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，因而可在一定浓度范围内能决定该机体生长速率。（二）恒化连续培养通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物多用于科研遗传学：突变株分离；生理学：不同条件下的代谢变化；生态学：模拟自然营养条件建立实验模型。一、自然界中菌种的方法步骤1.采样2.增殖培养3.纯种分离4.纯培养5.生产性能测定5.2菌种分离、纯化从生产中选育：在生产过程中，微生物以一定频率发生自发突变。为选育优良的生产菌种创造了机会。定向培育优良品种：一般指用某一特定因素长期处理某微生物的群体（culturepopulation），同时不断地对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变株的目的。采用梯度平板法（gradientplate）：筛选抗代谢拮抗物的突变株，以提高相应代谢产物产量方面的工作，可认为是微生物定向培育技术的一大进展。例如，异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物（即结构类似物），筛选抗异烟肼的菌株，可得到吡哆醇的高产菌。菌种分离的方法

将特定的微生物个体从群体中或从混杂的微生物群体中分离出来的技术叫作分离；在特定环境中让一种来自同一祖先的微生物群体生存的技术叫作纯化。分离技术主要是稀释和选择培养。

稀释是在液体中或在固体表面上高度稀释微生物群体，使单位体积或单位面积仅存留一个单细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体。最常用的为平板划线法。如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖过慢而难以稀释分离时，需要结合使用选择培养法，即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件来培养混杂菌体，改变群体中各类微生物的比例，以达到分离的目的。为保证分离到的微生物是纯培养，分离时必须用。例：定向培育抗异烟肼的吡哆醇高产突变株的方法

先在培养皿中加入10ml的一般琼脂培养基，使皿底斜放，待凝固后，将皿底放平，再在原先的培养基上倒10ml含有适当浓度（通过实验来决定）的异烟肼培养基，斜放、待凝。在制成的琼脂平板上存在一个由浓到稀的异烟肼的浓度梯度。然后涂以大量的酵母细胞，经培养后，在低浓度的异烟肼区域，长满了原始的敏感菌，在高浓度区域，酵母细胞生长受到了抑制，在浓度适中的部位出现少数由抗异烟肼的细胞所形成的菌落。这类抗性菌落可能因产生了可分解异烟肼的酶类，更多的是通过合成更高浓度的代谢产物——吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制作用。在酵母菌中，通过梯度平板法曾获得吡哆醇产量比原菌株提高7倍的突变株。应用同样原理，还可获得其它种种有关代谢产物的高产菌株。5.3微生物菌种的保藏和复壮衰退与复壮的概念衰退（degeneration）：在微生物的生长过程中，由于变异的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。

复壮(rejuvenation)：狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。防止菌种衰退的方法控制传代的次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的次数）创造良好的培养条件利用不同类型的细胞进行接种传代：对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种。采用有效的菌种保藏方法菌种的复壮措施纯种分离

菌落纯的分离方法（平板表面涂布法，平板划线分离法，琼脂培养基浇注法）

细胞纯的分离方法（分离小室进行单细胞分离，显微操纵器进行单细胞分离，菌丝尖端切割法进行单细胞分离）通过宿主体内生长进行复壮（如Bacillusthuringiensis的复壮）淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）菌种的保藏菌种保藏机构的任务：广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株以及动、植物细胞株和质粒等）的基础上，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。常用的菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心(ATCC)菌种保藏的原理挑选典型菌种的优良纯种一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）创造适于微生物长时期休眠的环境条件（如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸碱中和剂等）菌种保藏的方法

菌连续在培养基上（内）移种种生活态传代培养保藏法连续在活宿主上（内）移种保固体斜面藏湿法半固体琼脂柱方休眠态液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管内吸附在合适的载体上干法保藏菌种的方法

滴入小试管（在放入大试管干燥器中）藏在玻璃管内封入安培瓶菌液真空干燥法（L-干燥法）冷冻真空干燥法细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒）球块状载体（硅胶、瓷球）合适的载体有机基质（曲料、麦粒）滤纸片薄片状载体明胶小片（在蜡纸板干燥而成）血清蛋白小片（乙烯薄膜）

几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法真空冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类**产孢子微生物各大类3~6月