Agela液相色谱技术介绍色谱柱使用

提高分离度R，需要分别增大n，α，k值n：柱效，易受柱长、填料粒径的影响α：选择性，易受流动相和固定相影响；k：保留因子，受固定相和流动相的影响色谱分离基本方程HPLC柱的“色品”表达式第1页/共49页柱效（n）对分离度（R）的影响以上两张谱图k,α值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。“高富帅”第2页/共49页分离选择性（α）对分离度（R）的影响

α=1.04α

=1.35α

=1.50

改变分离选择性α的方法改变固定相改变流动相pH值改用不同的流动相

改变柱温第3页/共49页容量因子（k）对分离度（R）的影响容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，k的最佳范围是1<k<20。改变容量因子的方法有：减小柱死体积改变柱温改变流动相的配比梯度洗脱第4页/共49页αk'N如何控制分辨率?第5页/共49页

影响色谱柱性能的因素6色谱柱与色谱填料的特性1、柱填料

硅胶纯度粒径（及粒径分布）比表面积孔径2、色谱柱的构型

色谱柱直径色谱柱长度3、固定相键合类型残余硅羟基的影响反相键合相的保留行为键合硅胶的稳定性物理因素化学因素第6页/共49页AggregationPolymerization堆砌法硅胶Innoval、UHP、Bonshell

优点：高机械强度，耐污染共聚法硅胶Venusil、Durashell优点：分离效果佳

硅胶制作工艺第7页/共49页硅胶基质反相色谱分离三要素固定相流动相反相作用氢键作用弱离子交换作用反相作用氢键作用弱离子交换作用-R-OH-O-H+甲醇/乙腈水缓冲盐溶液目标物A、B疏水部分（链烃和芳香烃）羟基、氨基离子化基团第8页/共49页109876543210pHk’2486弱碱弱酸pH=pKORCOHORCOpH对分离的重要影响调节ph值对样品的分离非常有效第9页/共49页色谱柱固定相稳定性400-6068-099第10页/共49页400-6068-099Agela色谱柱最佳pH适用范围第11页/共49页中等pH下使用C18

VenusilMPC18(2),孔径110Å

特点：亲水性、通用性、

良好分离能力

第12页/共49页双层表面处理技术减低硅胶表面硅羟基的活性第13页/共49页中等pH下良好的分离能力色谱柱：C18，5μm，4.6×250mm，样品：吗啡、可待因，脱氢吗啡的分离，流动相:乙腈-25mM乙酸钠缓冲液（

pH3.5）=10：90，色谱柱A，硅羟基pH=3.5流动相pH=3.5，未能抑制硅羟基的活性二次保留严重VenusilMPC18（2），硅羟基pH=5.2流动相pH=3.5，能充分抑制硅羟基的活性抑制了二次保留效应400-6068-099第14页/共49页100%水流动相的兼容性

样品：尿苷

色谱柱：4.6*150mm,5μm

流动相：100%水

流速：1mL/min

温度：30℃第15页/共49页MPC18(2)pH2.6MPC18(2)pH5.8AtlantisT3pH2.6AtlantisT3pH5.8碱性化合物阿米替林在不同pH下保留时间的变化第16页/共49页YMCODS-AQpH2.6YMCODS-AQpH5.8HydroRPpH5.8HydroRPpH2.6第17页/共49页中等PH值范围，碱性化合物没有三乙胺添加剂也可提供更好的峰型第18页/共49页耐污染，高寿命，高耐受性的XBPC18

(L)孔径：150Å杂质不易进入空隙而强保留表面积减小，减小极性小物质的保留时间色谱柱：5μm，4.6×250mm；样品：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄甲醚；流动相：甲醇:0.1%磷酸=80:20；波长：254nm；柱温：室温；流速：1.0mL/min第19页/共49页高pH值流动相优势流动相pH对RPC保留的影响与样品类型（酸、碱、中性）的关系色谱柱：4.6*250mm，5μm，C18，流动相：0.025M磷酸盐、40%甲醇；样品：1水杨酸；2苯巴比妥；3非那西丁；4尼古丁；5甲基丙苯丙胺400-6068-099第20页/共49页核心技术-表面杂化技术宽泛的pH使用范围(2.0-12.0)

低硅羟基活性

高pH下拥有良好的寿命

对碱性化合物有很大的载样量，适用于制备Durashell液相色谱柱：

DurashellC18，C18(L)，C8第21页/共49页高pH条件首选

老化条件流动相：甲醇:pH=12三乙胺溶液=40:60流速：1.0ml/min;柱温：40℃;色谱柱：4.6×150；5µm；200Å测试条件流动相：甲醇:水=85:15流速：0.8ml/min检测波长：254nm;柱温：30℃;进样量：1µL色谱柱：4.6×150；5µm；200Å样品：尿嘧啶、苯酚、硝基苯、萘250h后初始：0h第22页/共49页强酸下使用的ASBC18色谱柱R=异丙基，防止键合相流失

优势

适用于pH0.8-4的流动相使得对pH较敏感的分离得到优化极低pH有较好的柱效和使用寿命第23页/共49页酸性条件下的良好寿命第24页/共49页酸性条件分离酸性物质第25页/共49页

亲水作用液相色谱柱

VenusilHILIC第26页/共49页与被分析物极性基团相互作用：增加极性化合物的保留与硅胶表面残余硅羟基相互作用：改善拖尾，改善极性化合物的峰型，提高分离效率；分离机理反相液相色谱（RPLC）是最广的色谱分离技术，可解决多种分析应用问题，但对某些分析物，特别是极性和亲水性化合物却无法或很少保留。长期以来，人们采用正相液相色谱(NPLC)，并使用不利环保的非水溶性流动相如己脘或环己脘来分析这些物质。但是在这种实验条件下，很多极性和亲水化合物往往很难溶解，从而限制了NPLC的应用范围。从现在起有了另一种新的解决办法，即选用亲水作用液相色谱-HILIC。第27页/共49页VenusilHILIC色谱柱：益母草中盐酸水苏碱的测定（中国药典2010版修订品种）对照品：理论板数（22757）、对称性（0.94）供试品：理论板数（17400）、对称性（0.80）色谱柱：VenusilHILIC柱(丙基酰胺键合硅胶)，100Å，4.6×250mm，5µm流动相：乙腈-0.2％冰醋酸溶液（80:20）；流速：0.5ml/min检测：蒸发光散射检测器（ELSD）；进样量：20µl；柱温：20℃盐酸水苏碱第28页/共49页葡萄糖分析流动相：乙腈－水（80∶20）流速：1ml/min柱温：30℃检测器：蒸发光散射检测器α-D-葡萄糖β-D-葡萄糖氨基柱：氨丙基键合硅胶VenusilHILC：丙基酰胺键合硅胶第29页/共49页分离水溶性维生素Time样品:VB1,VB6,VC,VB2色谱柱:VenusilHILIC4.6x150mm,5um流动相:0.1%TFA:ACN=90:10流速:1.0mL/min;检测波长:280nm;Temp:30℃；第30页/共49页地西他滨和杂质的分离色谱柱:VenusilHILIC4.6×150mm,5μm，流动相:ACN:H2O＝96:4;1ml/min;UV:244nm;roomtemp第31页/共49页Agela极其丰富的键合相各种专用柱（阿奇霉素专用柱、左卡尼丁专用柱、糖柱…）定制色谱柱（期待与您合作，开发属于您的专用柱）第32页/共49页

超高效液相色谱技术——

UHPLC色谱柱/Core-shell色谱柱第33页/共49页UHPLC色谱柱1.9μm粒径：比1.7μm压力低，耐污染耐压800bar键合相：UHPASBC18UHPAQC18UHPC18第34页/共49页Bonshell填料技术

内部为1.7um实心球外部为0.5um多孔外壳耐污染:粒径大同时物质不会进入硅胶实心球内部造成堵塞，较全多孔颗粒寿命更长。耐高压:1.7um实心球较普通3um硅胶更高的耐压性，耐压到800bar(12000psi),为高流速分离提供支持。第35页/共49页填料粒径对色谱柱柱效的影响第36页/共49页保持与1.9μm色谱柱相同分离速度和效果，却维持较低的系统压力第37页/共49页Bonshell-缩短了保留时间样品:太古霉素5µm传统C18,流速:1.0mL/min2.7µmBonshellASBC18流速:2.5mL/min第38页/共49页流动相:乙腈:1%甲酸=32:68UV:254nm流速:1.0mL/min.30°C进样量:5µL响应时间:4.0秒响应时间:2.0秒响应时间:1.0秒响应时间:0.5秒响应时间:0.1秒尿嘧啶乙酰水杨酸N-乙酰苯胺UracilAcetylsalicylicacidAcetanilide缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）检测器的响应时间对分离度的影响在UHPLC上值得重视第39页/共49页HPLC色谱柱的日常保养与维护

第40页/共49页新HPLC色谱柱的使用查看说明书，确定新色谱柱的保存溶剂(氨基柱，HILIC等)确定与检测所需流动相是否互溶使用互溶溶剂过渡，正反相溶剂过渡使用异丙醇流动相含有盐使用90%甲醇水过渡使用检测流动相平衡色谱柱10-20倍柱体积色谱柱使用后的保存溶剂（正相建议同说明书，反相纯乙腈或纯甲醇）强烈建议进行色谱柱使用分类（由样品类型来归类）第41页/共49页色谱柱不锈钢毛细管接头如果伸出的管线长度过长，可能漏液

螺母坡度不匹配，密封性差

死体积区如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积第42页/共49页0.13mm内径(红)用于毛细管HPLC中<2.1内径色谱柱0.18mm内径(黄)用于分析型HPLC中2.1~4.6内径色谱柱0.25mm内径(蓝)用于半制备型HPLC中10.0内径色谱柱0.5mm内径(橙)用于制备型HPLC中21.2内径色谱柱PEEK连接管线与接头色谱柱:4.6x30mm,3.5mm流动相:85%H2Owith0.1%三氟乙酸:15%ACN流速:1.0mL/min温度:35°C50

mL柱外体积（管线）4321Time(min)0.00.51.01.52.010mL柱外体积Time(min)0.00.51.01.52.04321样品:1.苯丙胺酸2.5-苯基-3,6-二氧-2-哌嗪乙酸3.Asp-Phe4.天冬甜素第43页/共49页色谱柱柱内体积和平衡时间

4.6x50 0.5mL 5min 4.6x150 1.5mL 15min 4.6x250 2.5mL 25min

2.1x30 0.06mL 3min 36sec 2.1x50 0.10mL 5min 60sec 2.1x100 0.20mL 10min 120sec

色谱柱 柱内平衡时间 尺寸 体积流速

(mm) (Vm)1.0mL/min

色谱柱 柱内平衡时间 尺寸 体积流速

(mm) (Vm)0.2mL/min1.0mL/min第44页/共49页颗粒物堵塞筛板引起柱压上升颗粒物来源：样品→离心，过0.45μm或0.22μm滤膜，注意滤膜性质泵和进样阀密封圈磨损→更换配置流动相→过0.45μm或0.22μm滤膜，注意滤膜性质缓冲盐析出→注意梯度运行和进样时盐的溶剂环境改变，甲醇对缓冲盐溶