新型苯扎溴铵对克氏原螯虾急性毒性实验研究

新型苯扎溴铵对克氏原螯虾急性毒性实验研究

在克氏原虾繁殖过程中，由于环境的变化，水产养殖池塘中的池底和水产养殖水体中的细菌、病毒和附生生物常导致虾病。新型苯扎溴铵作为虾养殖过程中的疾病治疗及水体消毒剂使用随着养殖水环境及药物滥用的发生,常引发各种疾病,而固着纤毛虫病是虾蟹养殖过程中的主要疾病,其由累枝虫、聚缩虫、钟形虫等附着类纤毛虫寄生在虾眼鳃及体表上引发的一类寄生虫疾病。目前这类治疗这类疾病的药物不少,作为最早开始使用的药物,孔雀石绿对固着纤毛虫有很好的杀灭效果,但因其高毒性、用药后生物体内残留时间长以及“三致”等毒副作用。早在2002年已被国家列入禁用药清单。此外有硫酸铵、硫酸铜、高锰酸钾、甲醛或戊二醛及代森类制剂还有传统中草药制剂,但这些药物有的成本过高,有的毒副作用大,有的还是禁用药1材料和方法1.1材料表面1.1.1正常、规格、无病无伤克氏原螯虾购自当地水产贸易市场,体长(8.9±0.6)cm,体质量(31.5±1.5)g/尾,体态正常、规格整齐、无病无伤。在实验室内用曝气48h以上的脱氯自来水驯养1周,每天正常投饲和换水,及时剔除摄食和运动不正常的个体,每天记录病死率,当病死率稳定在5%以下时方可用于实验,在实验结束前一天停止投饲,正常换水,确保实验动物处于空肠状态。1.1.2实验药物1.1.3u3000实验方法暂养及实验期间的实验用水是经过48h以上曝气处理的脱氯自来水,平均水温(18±1)℃,pH值7.5,溶氧量4.5~5.5μL/L,实验采用自然光照。实验容器是半透明水族箱,在使用之前用高锰酸钾溶液清洗浸泡消毒,清洗晾干。实验之前用设计浓度实验药品浸泡容器24h,减少实验中容器对药品的吸附,最后向每个容器中加入40L实验用水并加入新配的相应浓度药品,从低浓度组向高浓度组依次各放入相同数量、规格一致、体质健康的实验动物。1.2动物的急性毒性实验采用静水实验法根据药物的预实验结果在浓度间分别按等差和等比设计4个浓度梯度,用蒸馏水溶解实验药品并按照设计浓度梯度配置成便于取用的高浓度母液。临用时,用移液枪移取定量母液稀释成最高浓度组的设计浓度,然后按照等比浓度梯度稀释法稀释得到剩下四个浓度的药液。然后向各实验容器中加入40L经48h曝气自来水,再对应加入配好药液,从低浓度组向高浓度组依次放入规格一致、活泼健康的实验动物并设平行组和不加药的空白对照组。每24h换一次水,换水量为20L,每次换水前按浓度要求配置好,换水时从低浓度向高浓度进行。在实验过程中需要每天观察记录实验动物的反常行为、外观变化、中毒症状、死亡等现象。中毒后,多次刺激后无反应,放置在清水中30min后仍无反应则判定为死亡,及时捞出死亡个体记录死亡数量计算病死率。根据改良寇氏法计算苯扎溴铵对克氏原螯虾的安全浓度。1.2.1分组、给药与实验组将药品稀释或溶解配置成便于计算取用的高浓度母液,按照等比浓度梯度稀释法配置药液获得5个浓度梯度,从各试管中移取一定体积药液按标记加入实验容器中形成5个浓度组,实验设一个不加药物的对照组。新型苯扎溴铵实验组每个浓度组加入11尾规格一致、肢体健全、健康的克氏原螯虾。观察96h,记录24、48、72、96h病死率,得到克氏原螯虾对新型苯扎溴铵耐受浓度和100%致死的药液浓度。1.2.2消毒、清洗、饲养实验药品需要提前配制好便于计算取用的高浓度母液。容器需要进行标记编号,上面有实验药品种类、浓度、开始时间。先用高锰酸钾溶液消毒、再用对应浓度的药品浸泡24h。用清洗消毒的水族箱盛满自来水,48h不间断增氧曝气脱氯用作实验用水。虾在实验前暂养一周,驯养期间正常投饲、换水,实验前48h停止喂食以排空肠道,在实验前对实验动物挑选、测量记录体长体质量。新型苯扎溴铵组每个浓度投放6尾克氏原螯虾。1.2.3实验设计与观察记录新型苯扎溴铵实验药液配置采用等比稀释法,先取用一定量高浓度母液稀释得到6号浓度组的加药浓度。通过等比稀释获得新型苯扎溴铵的其余5个浓度的药液。配好的药液用移液管量取定量药液加入对应实验容器,配置好实验组溶液,然后按照低浓度到高浓度的方向放入实验动物。同一浓度设平行组,实验设不加药的对照组。实验时间不投饲,每24h换1/2的水,并加药保持原有浓度不变。实验开始后每24h观察记录一次水温、pH及实验动物活动情况、中毒反应、死亡情况。发现死亡个体及时记录、捞出。1.3平均病死率的计算数据采用Excel表格进行统计,根据实验动物死亡情况列表得出每个浓度的平均病死率,用改良寇氏法公式(1)计算半数致死浓度式中:X2结果2.1螯足、附肢体生长实验中,向32μL/L浓度组中放入试验虾后,出现中毒初期症状,虾活动剧烈,快速移动,此时用玻璃棒刺激会出现正常的抵御反应;药物作用一段时间后,活动能力减弱,螯足附肢收缩、僵硬、附肢出现抽搐,有的能爬行,行进非常缓慢,且动作僵硬不连贯,有的侧躺、仰卧,失去运动能力,用玻璃棒刺激尾部无任何抵御反应;24h内全部死亡,死亡时螯足、附肢僵硬呈收缩紧抱状态,正常缺氧致死的虾肢脚呈伸展瘫痪状态。8μL/L和16μL/L浓度组出现中毒症状,活动能力减弱,濒死的个体侧躺、仰卧,失去运动能力,在48~96h期间大规模出现虾的回避反应,侧身附着在箱壁露出水面。2.2急性毒性判定新型苯扎溴铵对克氏原螯虾的急性毒性实验结果见表1。在新型苯扎溴铵中克氏原螯虾24、48、72、96h的LC以96h半致死质量浓度为评判对象,依据国家环境保护局给出的新化学药品对鱼类急性毒性的危害等级标准(见表3)可知新型苯扎溴铵制剂属于高毒药物。3控制好用量,避免在一定时间上给克氏原螯虾造成危害根据新型溴铵产品说明,其治疗固着纤毛虫病如蟹居江氏伪钟虫的泼洒浓度0.35μL/L,施用浓度低于其对克氏原螯虾的安全浓度0.7μL/L。因此在一定浓度范围