7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的合成研究进展

7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的合成研究进展

perrin活性物质已经发展到第四代。抗癫痫药物的数量正大量增加。7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)是口服头孢类药物重要的中间体,主要用于头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定等抗生素的合成。20世纪70年代,出现了以青霉素为原料化学法合成7-ADCA的工艺路线。近年来,随着生物合成技术的进步,对生物酶的研究不断深入,相关报道层出不穷。另外,对微生物菌种进行细胞水平、分子水平等不同层次的设计,构建具有特殊功能的“工程菌”,可以通过发酵直接得到7-ADCA。化学法合成过程工艺复杂并且环境污染严重,生物法合成7-ADCA生产成本低且环境友好。随着生物合成技术的突飞猛进,不久势必取代化学法用于工业生产。2化学法合成7-ADCA在工业生产中广泛使用,以青霉素G钾盐为原料,分三步反应完成第一步是青霉素在氧化剂的作用下氧化成青霉素亚砜。有的氧化剂制备成本高、处理过程危险,有的氧化剂作用后所得最终产品质量差,因此对氧化剂性能的研究成为改进氧化过程的关键第二步是青霉素亚砜扩环重排为7-苯乙酰胺基法乙酰氧基头孢烷酸(又称头孢菌素G)。为了防止脱羧或其它副反应的发生,在扩环前需要将青霉素亚砜通过酯化反应转化为青毒素亚砜酯。酯化剂的选择不仅影响扩环、水解反应的产率而且也将影响到扩环反应的选择性。扩环反应以酸为催化剂在有机溶剂中进行,对扩环反应的研究集中在反应时间、温度、溶剂选择以及高效催化剂的寻求等方面。扩环反应以后,将头孢烷酸酯转化成游离酸,再直接水解脱去保护基团得到头孢菌素G。第三步裂解头孢菌素G,脱去7位上的苯乙酰基生成7-ADCA。一般采用五氯化磷、甲醇反应生成亚胺酯,然后水解得到7-ADCA。通过调节溶液的pH值,结晶得到7-ADCA固体产品。目前生物酶裂解头孢菌素G的工艺研究成熟并广泛应用于工业生产中,化学法裂解已经被淘汰。33.1酶法合成7-ADCA采用生物酶催化裂解和扩环反应受到各国医药行业的广泛重视。首先是青霉素酰化酶在生产中大规模裂解青霉素生产6-APA取得成功。由于酰化酶对底物的专一性主要取决于侧链结构,因此青霉素酰化酶也可以用于裂解头孢菌素G制备7-ADCA。青霉素亚砜酯扩环是制备头孢菌素G是7-ADCA合成工艺中的关键。青霉素扩环酶成为继青霉素酰化酶之后的又一个研究热点。3.1.1青霉素酰化酶青霉素酰化酶是一种双向作用酶,国内外对青霉素酰化酶的性质及在生产中的应用已经进行了充分的研究为了提高青霉素酰化酶的半衰期、循环使用和防止生产中大分子物质过敏,对酰的固定化及酶反应器形式方面的研究受到广泛关注。传统的酰固定化3.1.2扩环酶催化扩环反应的酶被称为脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶(DAOCS),也叫扩环酶。1976年Kohsaka和Demain首先对低等小型丝状真核生物顶头孢的无细胞提取液进行生物学系统扩环反应,取得了成功。1987年Baldwin等研究发现所有的扩环酶都显示出对底物青霉素侧链性质的高度专一性。除了青霉素N外,常见的异青霉素N、青霉素G或6-氨基头孢酶烷酸(6-APA)都不能作为底物3.2发酵法合成7-ADCA对青霉素和头孢菌素C生物合成的途径研究表明,在低等真核和原核产生菌中,β-内酰胺抗生素的生物合成途径基本相同,都是以形成LLD-ACV三肽开始,经过环化、差向异构化得到分支底物异青霉素N,经不同的合成酶催化,形成不同的β-内酰胺抗生素-青霉素、头孢菌素C和头霉素。在合成过程中鉴别、确定影响合成的限速步骤,增加微生物中编码该酶的基因表达量提高催化该反应的酶产量,可以提高发酵过程中7-ADCA的产量。产黄青霉和真菌顶头孢是自然界中产生青霉素和头孢菌素的主要途径,它本身并不产生差向异构酶和扩环酶,发酵后积累大量青霉素G和V,如果将扩环酶的基因构建成不同的质粒,并转化到产黄青霉中,使转化菌株对常见的青霉素具有扩环作用,可以在发酵过程中形成头孢环,经过适当的修饰后得到7-ADCA。扩环基因通常从棒状链霉菌中获得,棒状链霉菌扩环基因只能识别青霉素N,但对其编码扩环的基因进行修饰后,使得表达的扩环酶的底物专一性改变,可识别不同的青霉素衍生物。己二酰基-6-APA被认为是扩环酶的高效底物。Merck公司通过改造产黄青霉菌株,增加编码接己二酰基-6-APA底物扩环酶活性的基因拷贝数,向上述菌种培养基中加入己二酸或者己二酸盐,发酵得到己二酰基-6-APA,可以同时将己二酰基-6-APA扩环成己二酰基-7-ADCA;然后在己二酰基酰化酶的作用下去掉己二酰基侧链生成7-ADCA真菌顶头孢是自然界中产生青霉素和头孢菌素的主要途径。细菌棒状链霉菌中羟化和扩环两种活性由两个独立的酶承担,编码扩环酶基因CefE只有扩环活性而无羟化活性。而真菌顶头孢的扩环酶是双功能酶,编码扩环酶的基因CefE和编码羟化的基因CefEF同时存在,具有扩环和羟化两种不同的酶促活性。扩环酶基因CefE对青霉素N扩环生成去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC),断侧链得7-ADCA。羟化酶基因CefEF的存在对青霉素N扩环生成去乙酰基头孢菌素C(DAC),断侧链得7-ACA。发酵顶头孢后得到头孢菌素C、DAOC和DAC混合物。为了提高发酵顶头孢DAOC的产量,需要断裂顶头孢中的CefEF基因,使其羟化酶失活,阻止发酵过程中头孢菌素C的生成而积累大量的青霉素N。然后再转录棒状链霉菌中的CefEF基因,发酵后将有75%~80%的β-内酰胺物质转化为DAOC。DAOC经过两步酶法分别由D-氨基酸氧化酶(DAO)和戊二酰基酰化酶(GLA)断侧链生成7-ADCA3通过对生物酶的研究和改进,将其用于催化7-ADCA的合成反应,减少和避免有机