赤雹根总皂苷对fca诱导性关节炎大鼠肿瘤坏死因子-表达的影响

赤雹根总皂苷对fca诱导性关节炎大鼠肿瘤坏死因子-表达的影响

赤雨根具有苦味性寒、活血、消除充血、清热解毒的功效。这是辽宁省常见的满族药品。它经常被用来治疗风湿性腰椎和软组织损伤，疗效显著，无明显毒副作用。1材料和方法1.1免疫组化试剂盒TSTR提取所用赤雹根,经承德医学院赵春颖教授鉴定为葫芦科植物赤雹的干燥块根,TSTR由承德医学院中药研究所药理实验室提取,纯度为55.2%;雷公藤多苷(TG)片(安徽新陇海药业有限公司,批号100301);酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司,批号EK0526);弗氏完全佐剂(FCA,美国Sigma公司,批号100M8725);聚合酶链反应(PCR)试剂盒(大连宝生物工程有限公司,批号BK4501);PCR扩增引物(美国Invitrogen生命技术公司,批号HB120706536);兔抗鼠TNF-α一抗(美国Bioworld公司);免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司);其他试剂均为国产分析纯。1.2紫外分光光度计和icycarrpcr检测CSR-1-30型超纯水机(北京爱思泰克科技开发有限责任公司);YXQ-LS-30SⅡ立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);DU800紫外可见分光光度计(美国BeckmanCoulter公司);iCyclerPCR仪(美国Bio-rad公司);SIM-F124制冰机(日本SANYO公司);ESJ200-4电子天平(沈阳龙腾电子有限公司);TK-218型恒温摊片烤片机(湖北泰维医疗科技有限责任公司);YKH-I型液体快速混合器(江西医疗器械厂);RM2125型常规轮转石蜡切片机(德国Leica公司);BH-2型Olympus显微镜及摄像装置(日本Olympus公司)。1.3菌株:scxkSPF级,雄性8周龄SD大鼠60只,体重180~200g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,合格证号:SCXK京2009-0007。1.4方法1.4.1fca的注射效果随机数字表法取大鼠10只作为空白组,其余大鼠均于右后足跖部皮下注射FCA0.1ml,以注射点周围出现明显白泡为效果最佳,于注射FCA后第18天,关节炎指数(AI)≥6为模型建立成功。AI评判标准:肢体关节肿胀按0~Ⅳ级评分1.4.2灌胃药物的给予将模型大鼠随机分为模型组、TSTR40,80,160mg/kg组和TG12mg/kg对照组,各药物组均灌胃给予相应药物21d,空白组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。1.4.3血清离心腹主动脉取血,静置30min以上,3500r/min离心10min,取上清,将血清注入EP管中4℃保存备用。按照ELISA试剂盒说明书检测血清TNF-α含量。1.4.4pcr检测na表达取新鲜足趾100~200mg,加入1mlTrizol,置于匀浆器中,冰上充分研磨,匀浆液于离心机(4℃、12000r/min,15min)离心后,取上清液,加入0.2ml三氯甲烷,剧烈震摇30s,静置5min;同等条件再次离心后,小心吸取上清水相液(勿吸入中间蛋白层),加入等体积异丙醇,上下缓慢颠倒几次,使之混匀,-20℃冰箱静置2h后,冰上放置5min;再次相同条件离心,留取管壁侧部和底部的白色RNA沉淀,用75%乙醇[0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制]1ml,洗涤沉淀,重复3次,将洗涤后的RNA溶于20μlDEPC水中,放置-80℃冰箱,保存备用。取少量待测RNA样品,用DEPC水稀释100倍,紫外分光光度计测定RNA纯度,琼脂糖凝胶电泳法检测RNA完整性,反转录合成cDNA(反转录程序为:30℃,10min;42℃,30min;99℃,5min;5℃,5min)产物cDNA于-20℃保存。PCR扩增程序为:94℃预变性2min,94℃变性30s,57℃退火30s(不同目的因子采用相应的退火温度),72℃延伸1min,共30个循环,产物于-20℃保存。TNF-α上游引物5'-CGTCGTAGCCAAACCACCAAG-3',下游引物5'-CACAGAGCAATGACTCCAAAG-3',扩增长度426bp,退火温度57℃;β-actin上游引物5'-CATCCTGCGTCTGGACCT-3',下游引物5'-TCAGGAG-GAGCAATGATCTTG-3',扩增长度480bp,退火温度53℃反应液依照试剂盒说明书配制同PCR反应产物分析:配制含EB0.5μg/ml的2%琼脂糖凝胶,取4μlPCR产物与1μl5倍DNA上样缓冲液混匀,将电泳仪调至120V,25min,将电泳结束后的凝胶移至紫外透射仪下,观察并摄取图像。应用QuantityOne4.6.2凝胶定量分析软件测定图像的光密度值(IOD),进行定量分析。计算各目的条带与β-actin条带光密度的比值(ROD)。1.4.5免疫组化法检测tnf-蛋白表达将取材后的大鼠脾脏于10%甲醛固定液固定48h后,常规脱水、石蜡包埋、切片(免疫组化步骤按试剂盒说明书进行)、10×20倍光镜下观察TNF-α高蛋白表达情况,并拍摄图像;其中以细胞质中出现颗粒状淡黄色或褐黄色者为阳性细胞。采用IPP6.0软件测定足跖部TNF-α表达的免疫组化染色的IOD值,计算各组光密度平均值,进行半定量分析。阴性对照片用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗,其余操作步骤同上。1.5统计方法采用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析。2结果2.1各组血清tnf-水平比较模型组血清TNF-α含量[(0.98±0.08)ng/ml]明显高于空白组[(0.15±0.03)ng/ml,P<0.01];TSTR40,80,160mg/kg组血清TNF-α含量[(0.56±0.05)、(0.32±0.04)、(0.18±0.04)ng/ml]明显低于模型组(P<0.01);TSTR40mg/kg组和80mg/kg组血清TNF-α和TG对照组[(0.15±0.03)ng/ml]比较差异有统计学意义(P<0.05),治疗RA效果弱于TG对照组;TSTR160mg/kg组血清TNF-α和TG对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.2大鼠ras-pcr检测大鼠tnf-mrna表达各组内参β-actinmRNA表达较为均一,空白组TNF-αmRNA表达较少(0.1±0.02)。各药物组TNF-αmRNA表达均明显低于模型组(0.665±0.099,P<0.05或P<0.01);其中TSTR40mg/kg组(0.299±0.054)和TSTR80mg/kg组(0.27±0.045)大鼠TNF-αmRNA表达和TG对照组(0.162±0.036)比较差异有统计学意义(P<0.05),治疗RA效果弱于TG对照组;TSTR160mg/kg组TNF-αmRNA表达(0.077±0.01)和TG对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。2.3tstnf-表达与空白组(0.09±0.02)相比,模型组(1.52±0.28)脾脏TNF-α蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,TSTR各剂量组TNF-α表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01);其中TSTR40mg/kg组和80mg/kg组TNF-α表达水平(1.01±0.22,0.54±0.13)和TG对照组(0.39±0.11)比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),治疗RA效果弱于TG对照组;TSTR高剂量组TNF-α表达(0.47±0.15)和TG对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);见图2。3中医对于ra的认识RA是一种以慢性、侵蚀性关节滑膜炎为特征的自身免疫性疾病。目前为止,医学界还没有攻克RA这一世界性的难题,通常认为与T细胞免疫反应和B细胞产生自身抗体均有关,但其具体发病机制尚不清楚。RA患者中炎性细胞因子异常活跃已得到公认,特别是由单核巨噬细胞产生的TNF-α与RA的发病密切相关RA是一种反复发作性、以肢体小关节疼痛为主要病症的疾病,传统医学中多把此类病症归为“痹证”范畴,虽然没有RA这一病名,但是从患者体征、临床症状等,可以看出古代医家对该病认识由来已久。《黄帝内经》中就提出了“痹”病,如《素问·逆调论》所云“……病名曰骨痹,是人当挛节也”。东汉张仲景在《金匮要略·痉湿暍病脉证》中指出“病者,一身尽疼,发热,日晡所剧者,名风湿”。古代医家多认为气血不足,营卫