菠萝蜜总rna提取方法比较

菠萝蜜总rna提取方法比较

罗地亚和金针茅的又名木托罗、木托罗、木托罗、蜜年份、蘑菇和狗肠草。它属于蔷薇科和莫拉齐亚木托罗。它是印度的一种亚热带水果。1材料和方法1.1果实采集和处理供试菠萝蜜品种为‘马来西亚1号’,采集地点为广西壮族自治区亚热带作物研究所水果种质资源圃。选3株挂果树,随机采集健康无病虫害的叶片共计15张;为了便于运输回实验室且减少供试材料的浪费,每株树采摘1枚单果质量在15kg以下果实,共计3枚。上述材料采摘后立即带回实验室,用干净纱布清洁叶片表面浮尘,带一次性乳胶手套取出种子,清洗种子,然后用滤纸吸干表面水分,将叶片和种子分别放入封口袋内,置于-70℃冰箱中保存备用将研钵、研磨棒、药匙、试剂瓶、玻璃仪器、手术刀、医用剪刀等用0.5%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡过夜,然后放入高温灭菌箱,于190℃处理6h;将蓝色枪头、黄色枪头和离心管等塑料制品设备用0.5%DEPC水溶液浸泡过夜,然后放入烘箱,于55℃烘干;将1mol/LKOH放入电泳槽,保持6V/cm的电泳强度电泳5h,对电泳槽进行灭菌1.2方法1.2.1材料处理1采用液氮预冷研磨法将液氮注入保温桶内,1min后将研钵、研磨棒、药匙和离心管放入保温桶内预冷,液氮应没过所放入的试验器皿,1min后将所有试验器皿取出待用。在预冷试验器皿时,去除菠萝蜜叶片较大的主脉和侧脉,将去除叶脉的叶片放入经液氮预冷的研钵内待研磨。向研钵倒入液氮,用研磨棒将叶片碾碎,其间放入少许聚乙烯吡咯烷酮(PVP),待液氮汽化将结束时迅速研磨,研磨叶片成绿色干粉状即可。将叶片干粉转入预冷过的离心管中,置于-70℃冰箱中保存待用。2菠萝蜜种子研磨液氮预冷试验器皿同上。用酒精灯的外焰灼烧手术刀,至刀刃变红色后20s,将手术刀插入碎冰渣中降温。用手术刀将菠萝蜜种子切割成1mm厚的薄片。将薄片放入事先盛有液氮的研钵中,用研磨棒将薄片碾碎,待液氮汽化将要结束时,放入少许PVP粉末迅速研磨,重复此操作,直至菠萝蜜种子被研磨成白黄色粉末为止。将白黄色粉末转入预冷的离心管内,迅速放入-70℃冰箱中保存待用。1.2.2离心管提取沉淀操作步骤如下:(1)在研磨好的干粉内加入2mLTrizol试剂(天根生化科技有限公司),上下颠倒溶合,将离心管放在振荡器上振荡8min,静置1min;(2)加入等体积饱和酚(pH4.3)、氯仿和异戊醇的混合液(体积比为25∶24∶1),上下颠倒混匀并在振荡器上振荡30s,4℃下,11555r/min涡旋15min;(3)取1.5mL上清液转移到无RNase的离心管中;(4)加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液(体积比为24∶1),上下颠倒混匀,在冰上静置5min,此操作重复1～2次;(5)取1mL上清液,加入等体积异丙醇,混匀,冰上置20min,4℃下,11555r/min涡旋18min,留沉淀;(6)用预冷过的75%乙醇适量洗涤沉淀,4℃下,11555r/min涡旋5min,留沉淀,重复此操作2～3次;(7)放入通风窗内抽风干燥,用100μLDEPC溶解,放入-70℃冰箱中保存待用。23tir-硼酸提取法参考刘艳娜等32萃取试剂盒的方法试剂盒(北京天根生化科技有限公司)货号DP419,规格50次。具体操作步骤按照试剂盒使用说明书进行。1.2.3rna质量检测采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量(琼脂糖0.8%);使用紫外分光光度计读取吸光度值,计算230、260和280nm吸光度之间的比值分析RNA质量;使用Agilent2100仪器检测RNA的完整性。1.2.4tgaatctgaatctg、tgactg、tgactg、tdgetgatg利用Actin基因在任何植物组织中均能稳定表达的原理,利用primer5.0设计正反向引物,分别为:GTGCTCGAATCTGGTGATGC;AATTCCGGTTCCGCTGTG。20μL扩增体系为:2μL的10×PCR缓冲液,1μL的5.0mmol/LdNTP,各0.5μL的10μmol/L正反引物,0.3μL的5U/μLTaqDNA聚合酶,1μL的cDNA,加ddH2结果与分析2.1采用3种方法所提取rna的质量及产量比较分析Trizol提取法、Tirs-硼酸提取法和试剂盒提取法所提取菠萝蜜叶片和种子的总RNA,结果见表1。由表1可知,使用这3种方法均能提取菠萝蜜叶片和种子总RNA,但所提取RNA质量和产量不同。使用这3种方法提取时,其叶片RNA产率均大于种子RNA产率。使用这3种方法所提取RNA的A从操作难度、耗时、成本、RNA质量和产量5个方面对3种提取方法进行比较,结果见表2。由表2可知,每种方法各有优势,其中试剂盒提取法更适于菠萝蜜叶片和种子RNA的提取。2.2种方法所提取rna的表达RNA凝胶电泳图谱是最直观判断RNA质量的手段,根据18S、28S和5SRNA条带的带型和亮度可以判断RNA的提取质量。在质量分数为0.8%的琼脂糖凝胶上,用3种方法所提取菠萝蜜叶片和种子总RNA电泳结果如图1所示。使用3种方法均可提取菠萝蜜叶片和种子总RNA,且28S条带亮度均大于18S条带亮度。其中,采用Trizol提取法和Tirs-硼酸提取法所提取总RNA亮度较高,采用试剂盒提取法所提取总RNA亮度相对较暗,这与表1中总RNA浓度结果相一致,总RNA浓度越高条带亮度越亮。采用试剂盒提取法所提取RNA未能观察到5S条带,这也与表1中各浓度数据相一致。综合来讲,采用3种提取方法均可以获得带型完整、层次分明的总RNA,可用于后续相关研究。2.3rna的转录表达以采用3种方法所提取的菠萝蜜叶片和种子总RNA作为模板进行反转录,电泳结果见图2。由图2可知,所提取RNA样品均可被检测到该基因的转录表达。其片段约200bp。2.4菠萝蜜叶片和种子rna的检测在Agilent2100电泳检测中,即便是微弱的降解也可表现出来,RNA质量越好,其28S和18S的峰积分面积越大,其余杂峰越少且峰积分面积越小,同时28S峰积分面积接近18S峰积分面积的2倍,表明RNA质量较好。采用3种提取法所提取菠萝蜜叶片和种子RNA共计6份样品,通过Aiglent2100检测得到6份样品电泳图谱,结果如图3所示。由图3可见,6份电泳图谱均存在杂峰,且采用3种提取方法所提取种子总RNA所得杂峰总体较所提取叶片总RNA多。采用Tris-硼酸法所提取叶片和种子RNA样品电泳图谱的杂峰明显高于其他电泳图谱,说明采用Tris-硼酸提取法所得到的菠萝蜜叶片和种子总RNA质量较差;采用试剂盒提取法所提取叶片和种子RNA样品电泳图谱的杂峰较少,杂峰积分面积也较小,28S和18S峰积分面积较大,且28S峰积分面积达到18S峰积分面积的2倍,表明试剂盒提取法是提取菠萝蜜叶片和种子总RNA较好的选择。Agilent2100电泳图谱结果与紫外分光光度检测、凝胶电泳结果基本一致,与RIN值结果吻合。3采用试剂盒法所提取总rna的质量检测Trizol提取法、Tris-硼酸提取法和试剂盒提取法是常用的3种提取木本果树RNA的方法,按照其提取试剂组分比例及操作流程可以较大概率得到理想RNA。本试验中采用这3种方法提取菠萝蜜叶片和种子的总RNA,均可得到理想效果的总RNA电泳图和RT-PCR电泳结果。总RNA质量和产率分析结果表明,采用3种提取方法所得总RNA的A菠萝蜜叶片和种子中富含酚类、单宁等次生代谢物质以及大量纤维和淀粉,这些物质严重干扰高质量总RNA的提取与Trizol提取法相比,虽然Tirs-硼酸提取法加入β-巯基乙醇和乙醇等保护试剂,采用该方法所得菠萝蜜叶片和种子总RNA产率与采用Trizol提取法所得结果相近,但其A在采用试剂盒法所提取菠萝蜜叶片和种子总RNA的琼脂糖凝胶电泳图中虽未见5S条带,但28S和18S条带清晰可见,且RT-PCR电泳结果中在约200bp处有cDNA条带出现,说明RNA完整性较好;A以往有关植物总RNA提取方法的研究报道中鲜有涉及Agilent2100检测,Agilent2100检测可以高灵敏地检查最细微的RNA降解。Agilent2100检测结果表明,采用试剂盒法所提取菠萝蜜叶片和种子总RNA的电泳图谱杂峰极少,杂峰积分面积小,有明显的28S峰积分面积和18S峰积分面积,且28S峰积分面积是18S峰积分面积的2倍,而采用其他提取方法的28S峰积分面积未达18S峰积分面积的2倍,且采用Tirs-硼酸提取法所提取总RNA电泳图谱存在较多的杂峰。