小鼠胚胎干细胞的培养

小鼠胚胎干细胞分化为精于细胞的研究进展郑晨光生科091学号090304109(河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018)摘要：胚胎干细胞(ESCs)是一种具有分化发育为三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞，哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(PGCs),ESCs可分化为PGCs,并进一步分化为精子细胞。通过在培养基中添加诱导分化因子(如维甲酸等)或与希望诱导分化的目的细胞(如Sertoli细胞等)共培养，并通过鉴别ESCs分化为生殖细胞的各阶段特异性基因标志物c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mill和mil2等，获取不同阶段的生殖细胞。鼠的ESCs已诱导出了不成熟的精子细胞，但到目前为止尚无成熟精子培养成功，且诱导分化的效率很低。关键字：小鼠；胚胎干细胞；精子胚胎干细胞是由哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞，能在体外增殖，并能保持未分化状态。在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。目前，已从ESCs诱导出神经细胞、心肌细胞、肝细胞、骨细胞、胰岛素分泌细胞等。小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为精子细胞和卵母细胞，人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。2003年5月Hubner等成功将鼠胚胎干细胞体外分化为生殖系统的卵母细胞，并在Science上报道了该成果。近来有实验室从小鼠ESCs体外分化产生雄性原始生殖细胞，孵育分化后注入到卵母细胞可发育成囊胚，且检验为正常的二倍体核型。本文从小鼠胚胎干细胞定向分化为精子细胞的基因标记和方法学2个方面，对ESCs向精子细胞分化的最新研究进展作一综述。1原始生殖细胞的发育雌、雄鼠合笼至母鼠见阴栓后(dayspost-coitum,dpc)7d，鼠胚胎中出现原始生殖细胞(primordiralgermcells,PGCs),经过增殖，移行到生殖嵴，并继续分化为生殖干细胞(germstemcells,GSCs),这些细胞是精子和卵子发生的基础。大部分研究者都认为，PGCs是生殖细胞最初的形式，小鼠胚胎在三个胚层形成时，PGCs同时出现。PGCs从性腺原条移行到尿囊再移行到近端内胚层中，dpc7d后在中胚层远端可观察到PGCs,dpc8d移行到尿囊再到原肠，这被称为移行期PGCs,在dpc9.5-11.0d,移行至生殖嵴，这一阶段被称为移行后期PGCs,当PGCs分化为生殖母细胞时，睾丸或卵巢的结构就已经确立。对于雄性小鼠，生殖母细胞一直停留在有丝分裂期直到出生后2d,然后到达输精管基底膜或者停留在管腔中退化，那些存活下来的细胞则继续分化为GSCs,经过多细胞分化阶段，分化为精母细胞，精母细胞减数分裂为精子细胞，后者最终分化为精子。也就是说，在雄性胚胎中生殖细胞要经历移行前期PGCs、移行期PGCs、移行后PGCs、生殖母细胞、A型精原细胞、GSCs和减数分裂前生殖细胞，才形成成熟的精子。在这段复杂漫长的变化中，有多种不同的特异基因的表达。2生殖细胞分化的基因标记PGCs的很多标志物在未分化的ESCs上也有表达，摆在研究者面前的挑战就是如何区分这2种细胞。且ESCs在分化为PGCs的过程中，各个阶段的基因标记也不同。ESCs的分化依赖于特异基因表达，在生殖细胞分化中起关键作用的基因有c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mill和mil2等，这些基因的表达有阶段特异性，即在生殖细胞的不同发育阶段，它们分别稳定地表达，从而成为原始生殖细胞分化过程中的特异性标志。2.1减数分裂前生殖细胞分化的基因标记减数分裂前的基因标记包括OCT4、NANOG、Stella、GDF3、PUM1、PUM2、NANOS1,其中NANOG和PUM1对果蝇和蠕虫的生殖细胞的形成有重要作用。还有一些基因，如c-kit、VASA、DAZL从减数分裂前PGCs阶段一直表达到生殖细胞分化完成，是分化中的关键基因。c-kit在PGCs的表达水平较高，在PGCs和造血细胞中，c-kit的表达活性和单个DNaseI的高敏感位点相关。c-kit原癌基因的2种产物在控制雄鼠的生育力方面发挥了双重作用。c-kit的第1种产物是干细胞因子(stemcellfactor,SCF)的跨膜酪氨酸激酶受体，它表达于出生后睾丸组织中分化的精原细胞，并发挥其功能。第2种是一种胞内蛋白tr-kit,当通过选择基因启动子使精子发生时，它有明显的聚集。当它被注射到鼠的II期卵中时，可以触发卵的激活。在减数分裂的起始，c-kit停止表达，而tr-kit则在精子发生的减数分裂后期表达。干细胞因子/kit配子的跨膜受体由白斑基因编码，它在PGCs的正常扩增、存活和移行中发挥重要作用。雌激素刺激Steel基因转录，增加kit配子的产物，最终促使PGCs的正常生长。在原肠胚后期，OCT4仅在PGCs上表达，且在其全能性上有重要作用。用基因打靶的技术可以证实，OCT4的缺失会引起PGCs的凋亡。OCT4在不同性别的生殖细胞中表达不同，雌性胎儿在出生后,OCT4在生殖腺中的表达迅速降低，在卵子进入第一次减数分裂时就不再表达，在雄性则一直表达到生殖母细胞的形成和婴儿期的精原细胞中。DAZ(deletedinazoospermia,DAZ)基因家族的成员也可用来作为生殖细胞鉴定的标志，因为它们只在生殖细胞中表达。DAZ基因的同系物DAZL(DAZ-like,DAZL)的蛋白质产物在大部分雄性和雌性的生殖细胞中都表达，且对于PGCs的发育和PGCs来源的生殖细胞的成熟和分化都是必需的。基因fragilis和Stella在生殖细胞的发育中起到了重要的作用,它们是PGCs和减数分裂前生殖细胞的特异基因，在生殖细胞的特化中发挥作用。fragilis是一种跨膜蛋白，也是一种干扰素诱导蛋白。它的表达在PGCs的移行期增加，它还有抗增殖作用，可用来延长PGCs中细胞周期的时间。fragilis和Stella在ESCs和胚胎生殖细胞(embryonicgermcells,EG)中亦有表达，说明它和上述细胞的全能性有关；Stella和染色体重组及RNA转录后加工相关。将绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)作为Stella基因的报告基因制成转基因小鼠，可以精确地显示PGCs的发育过程。2.2减数分裂和减数分裂后生殖细胞分化的基因标记减数分裂和减数分裂后阶段特异的基因标记有VASA、联会复合体1,3(SCP-1,3),TEKT1等，经过减数分裂后就可形成单倍体精子细胞°VASA从减数分裂前就开始表达，它一直表达到减数分裂后生殖细胞的形成。VASA是一种细胞质蛋白，它只在卵巢和睾丸中表达，是生殖细胞高度特异的标志。VASA同源基因Mvh的表达产物由生殖嵴的体细胞诱导产生°Mvh基因的变异将会导致PGCs分化和扩增的缺陷。Toyooka等将ESC分化后表达阳性Mvh的细胞植入小鼠的睾丸中，最后形成了具有精子形态学特征的细胞。SCP3的表达对于第一次减数分裂的启动具有重要作用，是联会复合体轴侧成分的一部分，是检测哺乳动物发生减数分裂转变的高度特异性标志°TEKT在小鼠精母细胞和圆形精子细胞中可检测到，随着精子发生，TEKT1消失，在变长的精子尾侧端检测到TEKT1强阳性，推测TEKT1与中心体有关，可能参与成熟精子鞭毛轴丝的核化和基体组装，因此TEKT1是精子细胞分化后期的特异标志。2.3其它分子标志物除了这些基因的表达，还有一些其它的标志物:非特异性碱性磷酸活性、阶段特异性胚胎抗(stage-specficembryonicantigen,SSEA)、1和6抑制素及骨形态发生蛋白等。通过以上这些标志物，研究者可以从胚胎干细胞形成的拟胚体中分离出GSCs,并进一步分化为精子细胞。PGCs具有较高的AKP活性，但是现在还并不清楚该酶的活性对于这些细胞的生存是否必需。在PGCs分化为GSCs的过程中，AKP活性降低，c-kitSSEA-1的表达降低。在GSCs阶段又有新的表面标志，如1和6抑制素，c-kit在分化为A型精原细胞时再次出现。BMP是转化生长因子超家族的成员，它和PGCs的特化有协同效应。其胚外胚层分泌BMP-4和BMP-8b的功能最重要，它们单独并不能诱导外胚层分化为PGCs,二者一起和受体复合物结合，可将信号传递给转录因子，进而导致目的基因的表达°BMP-4通过PGCs和卵原细胞上的Alk3和R-Smad受体影响这些细胞，所以将它添加到ESCs和GSCs培养体系中，将促使ESCs分化为生殖细胞［4］细胞分化是基因调控选择性表达的结果，上述基因在ESCs、PGCs和GSCs阶段的关闭和开放，初步观察了精子细胞诱导过程中的基因表达，为进一步研究人类生殖细胞的发育提供了非常有价值的参考。3人类应用和展望2006年，Nagernia等已成功地从小鼠的ESCs中分化出不成熟的精子细胞。然后把这些细胞注射到小鼠的卵子中，结合后的胚胎被移植到雌鼠体内。最终分娩出小鼠并长成成年小鼠［6］。但是，目前在ESCs分化为精子细胞上的研究还仅停留在动物实验阶段°ESCs培养与分化的研究不但可以促进对人和动物生精机制的理解，还为生精功能阻滞的患者提供了一条解决生育难题的途径，为众多不孕不育患者带来了新的希望。近40年来，国内外大量研究者在体外诱导生精细胞减数分裂以及减数分裂后分化上做了大量工作［27］，但由于对生精细胞发育分化微环境缺乏足够的了解以及分离纯化各级生精细胞存在困难等原因，到目前为止，成熟的生精细胞体外培养分化系统仍未建立。十余年来，ESCs研究成果巨大，名列十大科学进展首位，ESCs向精子细胞的定向分化对于充分理解精子细胞发育中的调控具有特别重要的意义，对解决上述问题也有借鉴之处。由于鼠和人的ESCs有种属差异，影响鼠ES细胞分化为精子细胞的基因调控是否也会对人ESCs的分化产生影响？如何才能提高ESCs诱导为生殖细胞的效率？雄性配子和雌性配子在分化上的共性和差异在哪里？在体外将胚胎干细胞分化为精子细胞并进一步形成胚胎，对后代有无影响？通过对这些问题的研究，我们将会对生殖细胞的发育分化的分子潜能有更深的认识，从而促进核移植技术的发展并进一步发掘其潜在的治疗价值。参考文献蔡桂萱，韩嵘，尚克刚,.小鼠胚胎干细胞系的建立及其特性分析［J］.细胞生物学杂志，1996,18(3):126-26.黄冰,小鼠胚胎干细胞系的建立及其嵌合体小鼠的获得［J］.细胞生物学杂志，2001,23(1):28-31.孟国良，汤富酬，等.小鼠胚胎干细胞(ES细胞)建系和维持过程中的问题及对策［J］.遗传，2001,23(3):292-294.丛笑倩，姚鑫.小鼠胚胎干细胞(ES-8501)建系过程的核型及特性分析［J］.实验生物学报，1987,20(2):237-241.董晓，冯书堂.小鼠胚胎干细胞培养克隆分离传代研究［J］.畜牧兽医学报，2002,33(5):431-438.招霞，孙海翔，胡娅莉，等.ICR小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作［J］.医学研究生学报，2006