实验二细胞核与线粒体的分离与观察

实验二细胞核与线粒体的分离与观察实验二细胞核与线粒体的分离与观察一、 实验目的了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。二、 实验原理细胞核(nucleus)是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞中的能源物质一脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4C,避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿B(JanusgreenB)活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白(BSA)能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。三、实验仪器、材料和试剂材料大白鼠肝脏、玉米黄化幼苗(水稻、高粱等幼苗均可)。试剂动物细胞0.9%生理盐水(2)0.02%詹纳斯绿B染液(用生理盐水配制)(3)0.25mol/L蔗糖+0.01mol/LTris盐酸缓冲液(pH7.4):0.1mol/L三羟甲基氨甲烷10ml,0.1mol/L盐酸8.4ml,加双蒸水到100ml,加蔗糖到0.25mol/L。蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖(4)0.34mol/L蔗糖+0.01mol/LTris■盐酸缓冲液(pH7.4)(5)固定液：甲醇：冰醋酸(9：1)(6)姬姆萨染液:Giemsa粉0.5g，甘油33ml，纯甲醇33ml。先往Giemsa粉中加入少量甘油在研钵内研磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，561左右保温2h令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。用时吸出秒量用0.067mol/L磷酸盐缓冲液作10〜20倍稀释。0.067mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8):0.067mol/LKH2PO450ml0.067mol/LNa2HPO450ml(7)1%甲苯胺蓝溶液植物细胞(1)分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）,3mmol/LEDTA,0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA）。50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）配法:50ml0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与42ml0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。（2） 保存液：0.3mol/L甘露醇（pH7.4）（3） 20%次氯酸钠（NaClO）溶液。（4） 1%詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。器材高速冷冻离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙织物（或纱布）、玻璃匀浆器、瓷研钵、显微镜、天平、载玻片、盖玻片、微量离心管。四、方法与步骤（一）大白鼠肝细胞细胞核与线粒体分离细胞核的分离提取（1）制备大白鼠肝细胞匀浆1）实验前大白鼠空腹12h（空腹过夜，降低肝组织中脂肪含量），击头处死，迅速剖腹取肝，在冰浴的小烧杯中剪成小块，迅速用预冷的生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。2）称取肝组织2g,剪碎，用预冷到0〜4°C的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0〜4C条件下，按每克肝组织加9ml预冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用从层尼龙织物过滤备用。注意：先要求充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长且保持冰浴状态，以保持组分生理活性。（2）差速离心1） 先将0.5ml0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入0.5ml肝匀浆使其覆盖于上层°4C用冷冻高速离心机700g离心10min，得到沉淀A1和上清液B1。2） 用1ml预冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将A1重新悬浮，1000g离心15min，得到沉淀A2和上清液B2。3）用1ml预冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将A2重新悬浮，1000g离心15min，得到沉淀A3和上清液B3。（3）细胞核的鉴定1） 将入3以少量0.25mol/L缓冲蔗糖溶液重新悬浮，制备细胞核悬液，滴一滴于载玻片上，涂片，自然干燥。用1%甲苯胺蓝溶液染色，在光镜下观察，细胞核呈深蓝色。2） 同样得到细胞核涂片，自然晾干，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴姬姆萨染液染色10min。蒸馏水冲洗，吹干，镜检。结果：细胞核紫红色，上面附着的少量胞质为浅蓝色碎片。分离提取线粒体（1） 差速离心1） 将B1、B2、B3合并，100009离心10min，弃上清液B4，收集沉淀A4。2） 用1ml预冷的0.25moL/L缓冲蔗糖溶液将A4重新悬浮，100009离心15min，弃上清液B5，将沉淀再用1ml预冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将A4重新悬浮，10000g离心15min，弃上清液，收集沉淀A5。用少量0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将A5重新悬浮。（2） 线粒体的鉴定取B1-B5各阶段的上清液和A5沉淀悬液，分别一滴于载玻片上，涂片，不待干即滴加0.02%詹纳斯绿B染液，染色20min，镜检（为了有利于线粒体的有氧呼吸，可以不加盖玻片）。线粒体染成蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。比较B1〜B5各阶段的上清液和A5沉淀悬液染色后的差异。（二）玉米线粒体的分离玉米种子用20%次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱28^于暗处培育2〜3d。待芽长到1〜2cm长时剪下约15g,放0〜4°C1h。加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。3.用多层纱布过滤，滤液经700xg离心10min。除去核和杂质沉淀。.取上清液10000xg离心10min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。.沉淀为线粒体，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上匀浆化及离心均控制在0〜4°C进行。参照上面方法进行细胞核的鉴定。线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加1%詹纳斯B染色20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。五、作业与思考题作业(1