凋亡通路综述

细胞凋亡机制细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用；它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。凋亡是个井然有序的过程，大量的分子和途径参与了细胞凋亡发生。细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡(ProgrammedCellDeath,PCD)，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是有一系列酶参与、由基因控制的一个主动的、高度有序的死亡过程。细胞凋亡概念提出至今还不到35年的时间，但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中作用重要，引起人们对其机制和组分的广泛深入的研究，成为目前生命科学界研究的热点之一。但其凋亡的确切机制仍不清楚，本文从多个方面概述了细胞凋亡的机制。1、线粒体在细胞凋亡中的中央调控作用长期以来，线粒体一直被公认为是细胞内的能量加工厂，其主要作用是为细胞的各种生命活动提供所需的能量。然而越来越多的研究发现，线粒体具有调控细胞凋亡的作用，如细胞凋亡过程中的一类调节因子B细胞淋巴瘤/白血病基因2(Bcellcymphoma/leukemia-2，Bcl-2)/Bcl-2xl蛋白位于线粒体的外膜。非洲蟾属卵母细胞的体外凋亡过程也需要一种线粒体复合成分的参与。在研究人类细胞如何调控半胱氨酸-门冬氨酸特异蛋白酶(caspases)的过程中，人们发现了线粒体释放蛋白细胞色素C(cytC)、Smac/DIABL0蛋白以及凋亡诱导因子(AIF)等可以通过激活caspases通路导致细胞凋亡，或直接作用于细胞核引起细胞凋亡，这些发现为人们研究线粒体在细胞凋亡中的作用提供了线索。无论从原始的生物线虫到高级的哺乳动物乃至人类，还是从生物体外周器官到中枢神经系统，细胞凋亡都广泛存在。它作为生命的基本现象之一，可以发生在生理或病理条件下。最初人们仅从形态学表现的特征上加以认识，如胞膜对称性丧失、染色质凝集、细胞皱缩、DNA破碎、线粒体肿胀和凋亡小体形成。进一步的研究表明凋亡细胞形态学上的变化涉及一系列复杂的生化反应，是通过一系列酶参与的级联反应，涉及不同基因的表达及调控、信号传导系统的正负调控。凋亡过程中有许多关键事件集中在线粒体上，如电子传递链的变化、线粒体膜电位的异常去极化、超常的细胞氧化－还原反应。线粒体膜上具有调控凋亡的Bcl-2家族蛋白，该蛋白的结合状态将调节线粒体膜电位的变化，改变cytC、Smac/DIABLO蛋白以及AIF等的释放。从而通过激活caspase通路导致细胞凋亡。或直接作用于细胞核引起细胞凋亡。由此可见，线粒体除了具有经典的生物学效应外，还具有调控细胞存亡的重要作用。在细胞凋亡中，线粒体起着中心调控作用，在某种意义上，线粒体可以决定细胞的生存或死亡。线粒体具有氧化磷酸化、传递电子、贮存Ca2+、能量代谢、抗活性氧化等重要生理作用，它为细胞的各种生命活动提供基础能量。细胞凋亡过程中许多重要事件的发生都与线粒体密切相关，包括caspase激活因子的释放，女QcytC、电子传递链的改变、线粒体膜电位的丧失(△屮mt)、细胞内氧化还原状态的改变、Bcl-2家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等。不同信号的传导最终都集中到线粒体上来启动或抑制这些事件及其效应的产生。研究发现，凋亡早期线粒体结构保持完整，而坏死细胞的线粒体则发生肿胀，因此将其作为凋亡与坏死的一个重要区别。线粒体的结构和功能的改变，能加速核凋亡特征的出现，并是限制细胞凋亡进程中关键的一步。细胞凋亡的调控是一种复杂的多水平的调控，多种因素相互作用促进或抑制凋亡的发生。就现有的材料而言，更多的研究证据提示，线粒体在细胞凋亡的过程中可能起了促进的作用。线粒体可能通过释放与凋亡相关的蛋白，女QcytC、Smac/DIABLO蛋白以及凋亡诱导因子(AIF)等激活caspases，促进凋亡。且线粒体的此种促凋亡作用受Bcl-2和caspases的调节。但是人们对线粒体在凋亡中的作用机制还不清楚，女线粒体的释放蛋白如何作用于caspases,Bcl-2家族蛋白如何调控线粒体膜电位的变化，线粒体是否仅通过释放蛋白的方式来调控细胞凋亡等。目前对线粒体参与凋亡的认识均来源于离体细胞甚至亚细胞水平的研究，并无整体实验的证据。大多的研究证据仅来源于哺乳动物，在对节肢动物和线虫的研究中并未确定线粒体在凋亡中的作用。如前所述细胞的凋亡是一种高度保守的进化过程，因此开展不同类型动物的研究将有利于全面了解细胞凋亡过程。细胞凋亡的复杂性使人们很难判断哪一因素起了最为重要的作用。细胞凋亡时，原先位于线粒体膜间隙的某些与凋亡有关的活性物质释放到胞质中，这些物质包括cytC、Bcl-2及其家族成员、线粒体caspase等。cytC是电子传递链复合物III的一个组分，由核基因组编码，定位于线粒体内膜的外侧。研究表明，多种细胞应激包括DNA损伤、热休克和氧化应激等均可激活线粒体介导的凋亡通路致cytC释放。caspase是人体细胞的自杀基因。当细胞受凋亡信号刺激后，cytC从线粒体释放到胞质中，经级联放大作用，形成caspase9-caspase3活化复合物（凋亡体），最终引起细胞凋亡。Bcl-2是促进细胞存活、抑制凋亡的基因，是线粒体上的一种跨膜蛋白，它可通过阻止线粒体释放前凋亡因子cytC来阻断凋亡。而另一些Bcl-2家族成员Bax、Bak和Bid可插入线粒体外膜形成通道，释放凋亡活性物质。因此，线粒体结构和功能的变化是细胞凋亡的枢纽环节。cytC在凋亡中的作用近年来人们对凋亡的认识已经从细胞核的改变决定凋亡发展为重视线粒体的作用，因为它构成了细胞存亡的控制中心。凋亡过程中线粒体呼吸链电子传递中断，自由基产生，能量供应受阻。在检测到经典的细胞凋亡特征以前，线粒体膜完整性就已经发生了重大变化。这些变化涉及到线粒体内膜和外膜的改变，包括内膜跨膜电位的丧失和（或）蛋白质通过外膜的释放。线粒体在细胞存亡机制中的作用所以越来越引起人们的重视，一方面是由于线粒体膜间隙的cytC释放至胞质后触发caspase级联，导致细胞死亡；另一方面，线粒体外膜上的Bcl-2蛋白家族调控cytC从线粒体的释放。因此cytC是哺乳动物细胞凋亡信号传导过程的关键因素，对cytC释放的研究是目前的研究热点。大量证据表明，在多种细胞死亡模型中cytC从线粒体释放至胞质是引发凋亡的关键步骤，LIU等在试图纯化一种体外激活caspase所需的成分时提取出了包含cytC的组分。在无细胞(cell-free)模型系统中,cytC可激活caspase-3，从而触发细胞凋亡。此外，在无细胞模型系统和完整细胞中，Bcl-2或Bcl-xL的表达均可阻断cytC从线粒体释放，从而抑制caspase-3活化和细胞凋亡。在线粒体调控下的细胞凋亡与神经元的死亡过程有着密切的联系，包括cytC的释放入胞质和凋亡级联反应的起始。铝诱导的老年兔海马中的cytC从线粒体释放入胞质是凋亡的关键性步骤。cytC从线粒体释放并参与Apaf-1引起铝介导的凋亡级联反应。cytC释放后作用的机制尚未完全清楚，近年来的研究集中于cytC在介导对引发凋亡起关键作用的procaspase-9转变中的枢纽作用。释放的cytC与Apaf-1的结合可导致下游的caspase的活化或解除一种内在的抑制机制。Apaf-1的氨基末端组成一个caspase募集区(caspaserecruitmentdomain，CARD)，它可能直接结合于caspase。有研究表明热休克蛋白HSP70、HSP90可通过与Apaf-1的CARD直接结合而抑制cytC介导的Apaf-l-caspase-9寡聚体(apoptosome)的形成。近来凋亡研究的一个重要进展是发现线粒体可向胞质释放一些凋亡相关因子，启动凋亡反应，其中最重要的是cytC和AIF。大量研究表明，在凋亡初期cytC可以从线粒体内膜释放，从而启动了线粒体的凋亡机制。其释放的途径有两条：一条是线粒体通透转运孔(MTP)的开放；另一个是促凋亡基因Bax的诱导作用，引发了细胞的凋亡。但抗凋亡基因Bcl-2可以阻断cytC的释放和caspase的激活。研究证实Bcl-2家族蛋白，诸如Bcl-2.Bcl-xL和Bax具有成孔性质，估计它们直接调节线粒体膜对cytC的通透性。cytC的释放是细胞死亡程序中关键的一步。一种类似ICE的caspase的激活是Fas和TNF-a受体信号途径的早期过程。该酶的抑制阻止了cytC从线粒体中释放，也抑制了Fas介导的细胞凋亡。但至今还未证实caspase与线粒体膜的主要成分直接反应。在很多细胞凋亡实验中，caspase抑制剂并不能导致cytC的释放。caspase在细胞凋亡中的作用哺乳动物细胞中，在凋亡过程中起关键作用的一些含有半胱氨酸-门冬氨酸特异蛋白酶，被称为caspase。caspase主要以酶原形式存在于健康细胞中，通过活化发生蛋白水解获得活性。caspase有许多种，它们可以逐级水解活化，共同促进凋亡进程。线粒体释放的cytC能与Apaf-1及caspase-9形成一个复合体，在dATP、ATP存在下活化caspase-3，6，7等下游caspase，但需要高浓度caspase-8，体外实验在无线粒体的提取物中caspase-8能活化其他caspase导致DNA的降解，但核膜仍然完整。在线粒体存在时caspase-8的作用可被依赖cytC的caspase放大，加速凋亡的进行。事实上，活化的caspase自身可以刺激线粒体释放cytC，实验发现活化的部分caspase与分离出的线粒体作用，可改变线粒体膜的通透性，导致△出mt的崩溃。线粒体自身也含有一定量的caspase，通过单抗鉴定，caspase-3前体有一种亚型，位于膜间隙，受凋亡信号刺激后会释放出来。这样就有可能存在一个caspase和线粒体自身反馈的环，凋亡刺激导致线粒体cytC、AIF、caspase的释放，caspase的活化又促进诱发这一过程，这对于凋亡的加速和凋亡信号在线粒体间的传递是十分有意义的。与caspase有关的凋亡通路至少有3种：线粒体/细胞色素C通路、死亡受体通路和内质网通路。3.1线粒体/细胞色素C介导的凋亡通路各种促凋亡信号如DNA损伤、生长因子去除等诱导线粒体释放cytC。在ATP/dATP存在的情况下，cytC结合到Apaf-1的WD40重复区域，促使ApafT寡聚化，形成ApafT-cytC多聚复合体。此复合体通过ApafT氨基端的CARD与caspase-9原域的CARD之间的蛋白-蛋白相互作用，以1：1比例募集胞质中的caspase-9。caspase-9酶原之间因相互靠近自我剪切而活化。caspase-3和caspase-7也被募集到Apaf-1/caspase-9复合体中，活化的caspase-9激活caspase-3和caspase-7,从而启动了caspase级联反应。caspase-3是细胞凋亡的主要执行者，通过特异性地裂解一套底物而导致细胞凋亡。caspase-3和caspase-7具有高度的同源性、相似的功能和相似的底物特异性，都能酶切多聚ADP核糖聚合酶(PARP)和乙酰基-DEVD-7-氨基-4-甲基香豆素(Ac-DEVD-AMC),乙酰基-DEVD-乙醛(Ac-DEVD.CHO)是caspase-7和caspase-3的强有力的抑制剂。Bcl-2家族成员调节Apaf-1的活性。Bcl-xL能抑制Apaf-1/caspase-9的活化；Bik能拮抗Bcl-xL的功能。3.2死亡受体介导的凋亡通路死亡受体属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，包括Fas(又称CD95或Apol)、TNFR1(又称p55或CD120a)、DR3、DR4和DR5,在胞内部分都含有一个死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。3.3内质网介导的凋亡通路大量事实表明内质网在凋亡信号处理过程中发挥重要作用，导致下游caspase和其他蛋白酶的激活。虽然其确切机制还不清楚,但是内质网通路不同于线粒体或死亡受体介导的凋亡通路。内质网在维持细胞内钙离子内环境稳定，以及膜蛋白的合成、修饰和折叠等方面发挥关键作用。在几乎所有非肌肉细胞中，钙离子的储存、释放和摄取都受到内质网蛋白的调控。caspase-12位于内质网膜，是内质网应激(如内质网钙离子内环境紊乱以及过量内质网蛋白积累)诱导的凋亡所必需的。内质网应激诱导caspase-12表达，同时也导致胞质中的caspase-7转移到内质网表面。Caspase-7激活caspase-12，然后导致细胞死亡。研究表明，钙离子在凋亡的调节过程中发挥重要作用。钙网织蛋白(Calreticulin)是内质网腔主要的结合钙离子的分子伴侣，调节细胞内钙离子的动态平衡。Calreticulin的过表达导致细胞对毒胡萝卜内酯(Thapsigargin)和十字抱碱(Staurosporine)诱导的细胞凋亡敏感性增加。此过程与线粒体cytC释放增加有关。虽然特定的凋亡刺激可激活3种凋亡通路中的一种，但是在某些情况下3种通路之间是相互联系的。如上所述，caspase-8通过切割Bid把死亡受体通路和线粒体/细胞色素C通路联系起来；通过Ca2+内质网和线粒体之间也存在着密切的联系。但也有研究指出caspase在神经保护中也可以起到重要作用。caspase-3是细胞凋亡信号中最关键因子之一，但并非caspase-3增加，细胞便不再自救并直接进入凋亡。其实细胞在活化caspase-3时，caspase-3一方面会导致细胞的凋亡，同时另一方面它也会活化HSP70，诱导神经细胞的保护，两者共同作用决定了细胞的真正命运。该研究表明细胞凋亡并非是单一通路，而且细胞并非接到死亡信号（如FADD等）时便立即无选择性地进入凋亡，往往细胞会激活相对立的两个过程，凋亡和抗凋亡，两种信号通路的强弱对比决定凋亡或生存最后的命运。如果细胞的抗凋亡作用占上风，表明这个细胞尚有生存价值，它未必走向凋亡。Bcl-2家族在细胞凋亡过程中对线粒体功能的调控Bcl-2家族与秀丽隐杆线虫（C.elegans）的CED-9蛋白同源，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2,Bcl-xL,Bcl-w及Mcl-1）和促凋亡蛋白（如Bax，Bak及Bok）。除Bak之外，大部分Bcl-2家族蛋白通过羧基末端的疏水基插入到线粒体外膜上。Bcl-2蛋白家族调控cytC释放的线索之一来自于对Bcl-xL[27]三维结的研究。Bcl-xL是由两个位于中心的疏水性螺旋（5和6）和包绕于外周的亲水性螺旋构成的。Bcl-2家族的其他成员如Bcl-2、Bax和tBid（truncatedformofBid）与Bcl-xL均具有高度同源性序列。已证实Bcl-xL、Bcl-2、Bax和tBid能够在人工质体和双层质膜中形成功能性离子通道。这些通道都具有多种电导状态，对pH和电压敏感，对离子具有低选择性。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的通道的内在特性不同，前者形成的通道为阳离子选择性，而后者形成的通道为阴离子选择性，这可能与它们对cytC释放的相反的调控作用有关。Bcl-2蛋白家族与凋亡密切相关。随着人们对其研究的不断深入，其家族成员亦日益增加，其中包括抑制凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、MclT、Bfel、Al等和促凋亡蛋白Bax、Bcl-xS、Bad、Bak、Bik等,它们分布在线粒体外膜、核膜和内质网膜上，在线粒体上Bcl-2成片分布于线粒体内外膜接触处。Bcl-2对凋亡细胞的线粒体调控是多方面的，它能对抗神经酰胺诱导的△屮mt的丧失，并在完整和无核的细胞中均起作用。Bcl-2在线粒体外膜的过量表达抑制了叔丁基氢过氧化物(t-butylhydroperoxide，tbOOH)、prororophore和attractyloside诱导的MPT，却不能抑制其他因素，如500卩mol/LCa2+或肼(diamide)诱导的MPT。因此，Bcl-2只能在较窄的范围内抑制MPT的发生。Bcl-2抑制MPT的机制是阻止一些小分子如Ca2+从基质中释放以及AIF从内外膜间释放到胞质，而Bcl-2不能阻碍AIF的生成。此外，过量表达Bcl-2家族中能诱导凋亡发生的成员可能参与MPT的发生而阻碍线粒体释放AIF从而抑制凋亡的发生，可以说Bcl-2家族中能诱导凋亡发生的成员可能参与MPT的形成，而抑制凋亡的成员则阻碍MPT的形成。另外，Bcl-2还可以通过抑制cytC的释放而阻止凋亡的发生。文献报道抗凋亡蛋白Bcl-2在线粒体外膜上形成的阳离子选择性通道可允许质子从线粒体膜间隙逃逸至胞质，避免膜间隙过酸，从而抑制凋亡。膜间隙过酸促使细胞色素C自线粒体释放的机制尚不清楚。KUDLA等证实正常情况下以单体形式存在于胞质的Bax在受到凋亡刺激时构象发生变化，导致Bax寡聚体形成并整合到线粒体外膜上，随后即发生cytC自线粒体释放。这种迄今为止仅发现发生于Bax的寡聚化可能是促凋亡蛋白大型通道（megachannels）形成的机制。此外，已发现Bax和tBid可降低磷脂双层的稳定性，而Bcl-xL则不能，提示促凋亡蛋白可能通过直接降低线粒体外膜稳定性促进cytC释放。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡过程中的一类调节因子。已有大量的研究提示，此蛋白家族需定位于线粒体膜才能发挥调节凋亡的作用。主要表现为通过调节线粒体膜电位的变化，影响线粒体膜的通透性，进而改变线粒体蛋白的释放，调控细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括两类功能相反的蛋白质，一类是抑制细胞凋亡的蛋白，女口Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等；另一类是促进细胞凋亡的蛋白Bax、Bak、Bok等。Bcl-2相关蛋白包含不同数量Bcl-2保守区域（BH12BH4）。近年发现Bid、Bad、Bik等仅含有BH3同源区域的一类蛋白（BH32onlyprotein），在促进细胞凋亡的过程中发挥了重要作用。多种凋亡诱发因素，女死亡受体与死亡配体结合、细胞损伤因子等均可活化Bid蛋白，活化的Bid蛋白可通过两种途径促进细胞凋亡：①与Bcl-2、Bcl-xL等凋亡抑制蛋白结合，减弱其抑制凋亡作用；②与Bax、Bak等凋亡促进蛋白结合，使原来位于细胞质或松散定位于线粒体膜上的Bax、Bak插入线粒体膜，诱导线粒体蛋白的释放，促进凋亡。Bid蛋白的这种促凋亡作用在神经元凋亡中也有发现。Bcl-2家族蛋白调节线粒体蛋白释放的具体机制尚未明确。体外试验证明Bcl-2、Bcl-xL可在人工双层脂膜中形成通道，经X射线衍射和核磁共振（NMR）分析发现Bcl-2、Bcl-xl含两个反平行的疏水a2螺旋结构，与某些细菌的毒素蛋白成孔结构域相似。另有研究报道，Bcl-xL可以调节线粒体渗透性转换孔（PTP），维持线粒体的膜电位，从而抑制细胞凋亡的发生。以上研究表明，Bcl-2家族中抑制凋亡的相关蛋白可能通过调节线粒体膜通道的通透性来稳定线粒体，阻止线粒体释放cytC等凋亡相关蛋白，抑制凋亡发生。反之，促进凋亡的Bcl-2家族蛋白可能破坏线粒体膜的稳定性，促进凋亡发生。另有研究显示，当细胞发生凋亡时细胞质的pH值下降，胞质酸化与细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻共存。而细胞过度表达Bcl-2则可降低胞质的酸化程度，抑制凋亡。然而Bcl-2对凋亡的此种抑制作用是否通过线粒体介导尚待进一步证实。尽管Bcl-2对线粒体有直接的调控作用，但也有很多证据表明，其对内质网也有调控作用。越来越多的证据显示了内质网在凋亡调控中的积极作用，内质网应激也可以导细胞凋亡。而且内质网可以单独激活不受线粒体调控的caspaseT2因子，近来有报道内质网也可以诱导cytC的释放和caspase-3的激活，但这种作用可以被Bcl-2所阻断。Ghribi等在兔的脑池中注射铝制成的阿尔茨海默病模型的研究中发现，Bcl-2和Bax在内质网的表达也可以调节细胞的凋亡，并且其含量高于线粒体内的含量，Bcl-2/Bax的比值是决定cytC释放和caspase的激活的关键，而且在小鼠的研究中也得到了相似的结论。5NF-kB和神经元凋亡细胞核因子kB又称k基因结合核因子(nuclearfactorkgenebinding，NF-kB)，是一广泛存在于细胞中的具有多向性调节作用的蛋白质分子，参与细胞激酶、趋化因子、生长因子、细胞黏附因子及早期反应的蛋白质分子基因的转录，其活性受到一个强抑制物IkB的抑制。近年来研究结果表明：NF-kB能介导广泛的生物学作用，参与多种疾病的发生发展过程。NF-kB在细胞凋亡中有一定的作用。NF-kB是一种转录因子，有着广泛的生物学作用。1986年SEN等最初发现nF-kB是一种与免疫球蛋白k轻链基因增强子特定kB部位结合的蛋白质。NF-kB广泛存在于静止期细胞的细胞质中，其蛋白二聚体与特异性抑制蛋白一超级抑制物IkB形成三聚体，以非活化形式存在于细胞质。当细胞受到如病毒或细菌感染、紫外线照射和感染前期细胞因子等作用刺激后，IkB可发生磷酸化而失活，进而使NF-kB活化，进入细胞核内，随后NF-kB与胞核内某些基因的增强子的GGGRNNYYCC的基元结合，启动或调节早期反应基因的转录，参与炎症反应、细胞增殖和细胞凋亡。IM等首次发现在神经元中存在NF-kB，研究发现与大多数外周细胞不同，中枢神经系统尤其是大脑皮层和海马神经元内含有高结构型活性的NF-kB,推测这些NF-kB可能参与代谢非常活跃的神经元中抗氧化系统的调节。在神经元胞体、突触以及突触后致密层均已发现存在可诱导型的NF-kB活性，提示其作为信使将突触信号传递到核内。研究也证实在胶质细胞，如星形细胞、小胶质细胞及许旺细胞胞质中存在非活性的NF-kB。中枢神经系统（CNS）内激活NF-kB的信号主要有以下两类：第一类信号在外周组织也存在，包括炎症细胞因子（TNFa，IL-1）、氧化应激、紫外线、细菌和病毒产物等；第二类为CNS特异的信号，包括去极化、神经递质（谷氨酸、阿片样物质）、神经生长因子以及几种不同的神经毒性刺激，如高浓度的谷氨酸、糖基化牛磺酸、价淀粉样蛋白等。有关NF-kB是诱导细胞死亡还是促进细胞存活仍有争论。GRILLI等在培养的小脑颗粒体细胞和海马脑片中发现水杨酸可通过抑制谷氨酸对NF-kB的激活而阻止谷氨酸诱导的细胞死亡；MAIZO等发现NF-kB的激活介导了谷氨酸引起的纹状体神经细胞的凋亡；GREEN等发现自由基清除剂能通过抑制NF-kB的激活而减轻兴奋性毒素引起的纹状体神经细胞的凋亡。但越来越多的证据表明活化的NF-kB具有抗凋亡作用。用IkB反义核酸处理，即激活NF-kB能减轻B淀粉样蛋白对海马神经元的损伤作用；且证明具有神经保护作用的可溶性APP是通过激活NF-kB而起保护作用的；NF-kB的激活剂TNF-a和神经酰胺能保护培养的海马神经元免于兴奋性氨基酸和氧化应激的损伤，是通过引起kB反应基因Mn-SOD和钙结合蛋白的转录而起作用。研究结果的不一致可能与以下因素有关：①在不同的细胞中，不同NF-kB亚单位表达量的不同，使得NF-kB二聚体的组成不同，从而影响NF-kB与其靶基因调控区DNA序列的结合，进而影响基因表达；②在不同细胞中与NF-kB同时激活的其他转录因子或同一类细胞中由于激活及代谢状态的不同均可影响NF-kB的最终效应，如已证明HMG样蛋白能决定NF-kB是起转录激活剂还是起转录阻遏物的作用；③外界刺激强度的不同也可影响NF-kB的效应。如在生理条件下，谷氨酸受体的激活引起胞内Ca2+浓度的短暂升高，导致少量转录因子的激活，而在病理情况下，突触间隙谷氨酸含量的增加和（或）异常刺激的谷氨酸受体，使得激活的转录因子的数量增加，进而使转录的NF-kB靶基因的数量或水平增加，最终改变细胞的反应.大量研究表明，活化的NF-kB在细胞凋亡中具有抗凋亡和促凋亡的双重作用。NF-kB在神经细胞凋亡的网络中起着枢纽作用。NF-kB的不同作用可能与下列因素有关：在不同时间、部位以及其二聚体的组成不同，调控不同靶基因DNA序列而转录不同蛋白质进而影响凋亡的进程；与NF-kB同时激活的其他转录因子或由于激活及代谢状态不同而影响NF-kB的最终效应；外界刺激强度不同导致NF-kB的效应不同。目前存在的问题是NF-kB在何种情况下激活抗凋亡基因转录，在何种情况下调控促凋亡基因转录，与被调控的蛋白质翻译量（剂量-效应）之间的关系如何，抑制蛋白IkB的亚类是否和转录的蛋白种类有关，进而和凋亡进程关系是否相关；更进一步，IkB的各种类型与下游通路之间是否存在点对点关系及其与凋亡的关系如何等等。总之，细胞凋亡的调控是一种复杂的多水平的调控，多因素相互作用促进或抑制凋亡的发生。对细胞凋亡分子机制的探讨是当今一个热点，除了以上这些基因蛋白在细胞凋亡过程中起到非常重要的作用外，还有许多基因蛋白在凋亡中也起着很重要的作用，还有许多基因蛋白也许是人类还没有认识到的。细胞凋亡的复杂性是使人们很难判断那一因素起了最为重要的作用，相信通过新的研究和新的发现将为人们带来新的认识，不仅有利于人们更完整地了解细胞的凋亡机制，而且有利于人们找到有效的手段来调控细胞的凋亡过程，为人类的健康和有效生存服务。目的蛋白表达意义凋亡促进基因：有ced-3,4、p53、ICE、bcx-Xs、TGFB等，其中P53基因是一种抑癌基因，有野生型和突变型。野生型P53对细胞凋亡有促进作用，突变型P53则失去此功能。故P53基因的功能状态是影响细胞凋亡的主要因素。凋亡抑制基因：有bcl-2、ced-9、bcl-X等。其中最主要也是当前研究最多的是bcl-2,是B细胞淋巴瘤/白血病-2基因的缩写形式。在正常人体内定位于18q21。bcl-2是目前发现的与凋亡关系密切的原癌基因之一。细胞凋亡及其相关因素在酒精性肝病中的作用酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD)是因长期过量饮酒引起的中毒性肝脏疾病，为慢性酒中毒的主要表现。它主要引起肝脏的3种损伤,即：脂肪肝(AFL)、酒精性肝炎(AH)和酒精性肝硬化(ALC),3者可单独出现,也可同时并存或先后移行。重度酒精中毒造成的肝损伤往往威胁到患者的生命。随着酒精饮品消耗量的增多，ALD的发病率也随之上升。关于ALD的发病机制，目前尚未完全阐明。过去只注意研究酒精本身或其代谢产物对肝细胞的直接毒性作用以及营养失调、肝脏代谢异常和脂质过氧化等变化在ALD发病学中的作用。近年来，发现免疫反应和细胞基因异常调控及凋亡机制参与ALD的病理损伤过程，认为细胞凋亡是造成ALD的主要因素，并且Fas(CD95)系统、肿瘤坏死因子a(TNFa)及其受体(TNFR1、TNFR2)等与凋亡密切相关的基因异常表达，对ALD的发生发展起着十分重要的作用。随着ALD分子病理学机制研究的逐步深入,有望给ALD的治疗带来新的思路和新的突破。一、细胞凋亡与ALD细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程。凋亡是正常细胞现象,但也可被许多外部因素激发,提示激活调亡控制基因的机制可以不同。肝细胞凋亡发生在肝发育和成人肝的肝细胞更新时,也发生在各种病毒性、免疫、肿瘤和药物引起的肝脏疾病。在ALD患者肝活检中发现Mallory小体和凋亡标志物同时出现在同一肝细胞内，提示含Mallory小体的肝细胞可能以凋亡的方式被清除。Zhao等用末端核苷酸转移酶(TdT)脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)缺口末端标记(TUNEL)法检测,43例ALD患者肝活检标本中的肝细胞凋亡率为4%~5.3%。长期给小鼠酒精饮食后可见鼠肝细胞中凋亡小体明显增多,并伴有不同程度的肝损伤,如脂肪肝、炎症等,表明在人类、动物酒精诱发肝损伤的过程中确有肝细胞凋亡的发生。在大鼠ALD的逐渐发展过程中，不仅凋亡的肝细胞不断增加,而且肝细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)阳性率也随之上升。在小型猪ALD模型中也可见到不仅肝细胞凋亡小体随着ALD的发展而明显增多，肝细胞的PCNA阳性表达率也逐渐增高,提示在ALD中肝细胞凋亡现象及其再生修复同时存在oZiol等认为，肝细胞凋亡在ALD的发生发展中起重要作用，ALD肝细胞凋亡代表在肝细胞增殖的刺激下肝脏的重塑，以维持肝脏的正常形态。在这种情况下肝细胞凋亡与肝损伤再生密切相关，以保持细胞凋亡P细胞增殖平衡。为证实肝细胞凋亡在ALD中的作用，Zoil等和Natori等分别用不同方法检测AH患者肝细胞凋亡率、中性粒细胞浸润率、caspase表达以及血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)等指标，以研究它们之间的联系。在Ziol等的临床研究中，AH患者肝活检中均可见肝细胞凋亡，凋亡率在0.3%~28%，平均凋亡率为6.2%，病理检查可见凋亡肝细胞与Mallory小体和中性粒细胞聚集，并且肝细胞凋亡率与中性粒细胞浸润率显著相关(r=0.8，P=0.0001)。与此相反，肝细胞气球样变性与凋亡、中性粒细胞浸润无关，表明凋亡是AH肝细胞死亡的主要形式oZoil等并不否认肝细胞坏死机制在AH发生发展中的作用。就肝细胞凋亡与坏死的关系而言，酒精可以通过不同的机制在同样的区域同时诱导肝细胞凋亡或坏死。正常情况下凋亡细胞的清除不伴随炎症反应，如果凋亡作用足够抗拒被消除的过程，肝组织破坏也会伴随炎症反应。Natori等认为，细胞凋亡是ALD的重要病理特征，在他们的研究中AH组肝细胞凋亡率是正常对照组的6倍[(0.33?0.04)~(2.0?0.31)]，AH组caspase表达强阳性，对照组则为阴性，并且肝细胞凋亡率与肝损伤的生化指标(如:AST、TBIL)及组织病损程度相关，进一步证实凋亡在ALD的发病机制中起着重要作用。二、ALD时细胞凋亡发生的机制Caspase-3因子属于caspase超家族成员，是细胞凋亡的重要标志。Caspase-3一经激活并致底物裂解，细胞凋亡将不可逆转的进行下去。现认为有两条通路激活caspase效应分子：第一条通路包括死亡因子和死亡受体;第二条通路则与线粒体功能失调有关。死亡受体是TNF超家族成员，其中以TNFR-1和Fas为主要成分，在被它们的配体TNFa、FasL激活后，聚集形成死亡复合体，激活一系列起始caspase分子，再依次激活下游caspase效应分子，引起调亡。包括Bax、P-53、c-Myc、活性氧成分在内的多种刺激物激发线粒体内细胞色素C,通过开放位于线粒体内膜的线粒体渗透性转换孔(mitochondriapenmeabilitytransitionpoie，MPTP)使之从线粒体中释放出来，与其他蛋白包括凋亡激活因子-1(apoptosisactivatingfactor-1,Apa-f1)、活化caspase和其他caspase效应分子结合，激发凋亡。(一)Fas系统Fas系统包括Fas、FasL及它们的可溶性形式,Fas又称Apo-1、CD95,属于TNFR超家族成员，由胞浆区、跨膜区和胞外区3部分组成。Fas胞浆区含70个左右对于凋亡必不可少的氨基酸系列，称死亡区，是Fas介导凋亡的生物学基础oFas广泛分布于各种组织细胞表面，如肝细胞、中性粒细胞等。FasL则主要分布于活化的T细胞表面，正常肝组织内未发现FasL表达，ALD患者肝组织表达FasL。Fas可直接诱导靶细胞凋亡，且作用迅速，靶细胞无需致敏。给大鼠注射Fas抗体，数小时即可引起大量肝细胞凋亡造成严重的肝损伤。Xia等对酒精性肝硬化患者的肝组织冰冻切片进行FasLmRNA原位杂交检测，发现肝假小叶中央细胞有大量的FasLmRNA表达，假小叶周边淋巴细胞浸润处的FasLmRNA却阴性。最近的研究表明，在酒精性肝损伤过程中，Fas系统不依赖于细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,而依赖于肝细胞本身,可能以3种不同方式介导凋亡：（1）肝细胞表面以膜结合方式表达的FasL,与相对应肝细胞表面的Fas结合，发生肝细胞之间的互相杀伤；（2）分泌至细胞外的可溶性FasL与其他肝细胞表面Fas相结合，诱导凋亡（旁分泌方式）；（3）细胞表面的Fas与自身分泌的FasL结合，导致凋亡（自分泌方式）。在Natori等的研究中，ALD患者肝细胞表面Fas的表达明显高于正常对照组，推测ALD中Fas表达上调可能是酒精诱发肝细胞凋亡的重要机制，抑制Fas表达即可达到抑制凋亡的目的，这将给ALD的治疗开辟新的途径。（二）TNFa及其受体TNFa是具有多种生物学活性的细胞因子，由活化的单核巨噬细胞产生，TNFR1、TNFR2是其受体，存在于多种细胞表面oTNFR1含有一个诱导细胞凋亡所必需的独特结构模块，由大约80个氨基酸残基组成，称死亡结构域，TNFR2则无此结构。TNFa的大多数生物学效应是通过TNFR1介导的，TNFa表达的增加可诱导肝细胞凋亡，TNFa和肝细胞的TNFR1具有高度亲和力，对低浓度的TNFa即可发生强烈反应。此外,TNFa又可激活核转录因子（NF-kB），后者具有抗