第12组-激活沉默基因以获取新型微生物次级代谢产物的策略研究

组员：季宗德郭秋香张羡媛赵琪激活沉默基因以获取新型微生物次级代谢产物的策略研究1

根据2007年的统计，1981～2006年间国际上所有批准的药物中，超过50%来源于天然产物、天然产物的衍生物或模拟天然产物药效基团的合成化合物。尤其是，目前临床上使用的60%的抗癌药物和70%的抗生素是天然产物或者基于天然产物研发的药物。

从微生物中发现和分离新型化合物是发展新型药物的主要方向之一.

一直以来，天然产物在人类疾病的治疗过程中发挥着重要作用。2非常值得思考的问题：

随着大量微生物次级代谢产物的分离,从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物变得越来越困难。临床上病原微生物的耐药性日益严重，艾滋病、禽流感等新型疾病不断出现，我们亟需新的研发策略发现新型天然药物。3

随着基因组测序技术的飞速发展和微生物基因组大规模测序的广泛开展，目前已测定了超过580个微生物的全基因组序列。中国科学家更是于2009年发起了“万种微生物基因组”计划，预计在3年内完成1万种微生物物种全基因组序列图谱的构建。4

在常规培养条件下，大多数生物合成基因簇不表达或以极低水平表达并在特定条件下被激活而表达活性产物，这些DNA序列称为沉默生物合成基因簇。

沉默生物合成基因簇包含了多种结构类型的微生物次级代谢产物编码信息,提供了丰富的合成生物学天然元件或模块,并为未来设计和构建新型微生物次级代谢产物生物合成途径提供丰富的物质基础。

因此，如何利用现有的研究成果和技术手段进行激活沉默基因以获取新型微生物天然产物已经成为当务之急.5沉默基因簇的异源表达转录因子调控策略表观遗传调控策略41235核糖体工程策略6宿主细胞的遗传修饰改造7单菌多次级代谢产物策略6天然生产菌表达水平低遗传操作困难不容易规模培养

不能应用于工业化生产生长缓慢沉默基因簇的异源表达17

所谓基因的异源表达，就是将整个沉默合成基因簇克隆至质粒、黏粒或者细菌人工染色体上．利用异源宿主对其进行表达，然后利用相关的分析技术对含有该克隆的表达宿主以及对照宿主的发酵液上清或者提取物进行分析，最终对该代谢产物进行分离、纯化和结构鉴定。8异源表达使得沉默基因在新的表达系统中无需按照原来的起始位点进行有效转录，对培养条件也无特殊要求，克服了天然生产菌表达水平低、遗传操作困难、不容易规模培养等缺点，为工业化生产扫清障碍。另外，它还适用于生长缓慢的微生物，如蓝细菌、真菌等。由该法已发现多种新的生物活性物质。9良好的异源表达宿主：链霉菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌和黄色粘球菌遗传途径的转移功能基因表达蛋白活性对宿主细胞的影响实现天然产物异源表达生物合成必须要解决以下几个问题。10正调节基因进行组成型表达负调节基因的中断启动子的替换转录因子调控策略转录因子调控策略211正调节基因进行组成型表达和负调节基因的中断

沉默基因簇中含有的正调节基因和负调节基因，控制次级代谢产物生物合成的开关。对正调节基因进行组成型表达或对负调节基因进行阻断,可以激活沉默基因簇,获得微生物新型次级代谢产物。Laureti等对生二素链霉菌的不转录表达的途径特异性正调节基因samR0484进行组成型表达后，激活了沉默基因簇,最终得到新型天然产物stambomycins，并可能成为抗肿瘤药物开发的先导化合物。余贞等中断变铅青链霉菌的负调控基因nsdA，最终合成放线紫红素。12启动子的替换将可诱导的启动子替换原有转录因子的天然启动子，转录不再受原有的微生物控制，同时新的启动子能够使转录因子高水平表达，反过来又激活整个沉默基因簇的表达。[14]ChiangYM,SzewczykE,DavidsonAD,etal.Ageneclustercontainingtwofungalpolyketidesynthasesencodesthebiosyntheticpathwayforapolyketide,asperfuranoneinAspergillusnidulans[J].JAmChemSoc.,2009,131(8):2965-2970.在适合于分子遗传操作的微生物中，许多次级代谢生物合成基因簇含有一个或者多个能够控制整个基因簇转录的转录因子。这种方法的优点是产物是立即归于目标基因簇和产量增加的潜能，但不适用于受翻译后调控的转录因子和不包含转录