耐亚胺培南鲍曼不动杆菌耐药机制研究

耐亚胺培南鲍曼不动杆菌耐药机制研究

博曼运动是一种非发酵的阴性革兰氏菌。它广泛存在于医院环境中，可以长期生存。如果患者的身体吸引力较低，可能会导致各种器官和组织感染，如肺炎、脑膜炎、尿道病、伤口感染和细菌感染。近年来,随着广谱抗菌药物及免疫抑制剂的广泛使用,该菌的分离率与耐药率逐年增高,碳青霉烯类抗生素曾经是治疗鲍曼不动杆菌重症感染的首选药物,但近几年鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率增长速度非常快,临床经常能检测到广泛耐药鲍曼不动杆菌,耐亚胺培南鲍曼不动杆菌(CRAB)给临床抗感染治疗带来严峻挑战。为此本研究调查了本院2012年临床分离的CRAB对常用抗菌药物的耐药性及其耐药机制,旨在为临床治疗提供实验依据。1材料和方法1.1相同部位重复分离株收集南昌大学第二附属医院2012年1月至12月临床分离的耐亚胺培南鲍曼不动杆菌共84株,去除同一患者相同部位重复分离株。其中痰液41株、血液27株、伤口分泌物6株、腹水4株、尿液3株、引流液2株、脑脊液1株。另外选取对β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类抗菌药物均敏感的鲍曼不动杆菌共4株作为敏感株(编号S1.2药物、试剂及仪器Vitek-32型全自动微生物分析仪及配套鉴定卡(法国Bio-merieux公司);MG48G型基因扩增仪(杭州朗基科学仪器有限公司);DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂);UV-3A型紫外透射分析仪(珠海黑马医学仪器有限公司)。抗菌药物纸片及MH营养琼脂均为英国Oxoid公司产品;2×TaqPCRMasterMix、DNAMarker(D2000)购自北京天根生化科技有限公司。1.3菌株鉴定及药敏试验菌株分离按照《全国临床检验操作规程》第3版进行,获得纯培养后,经革兰染色、氧化酶试验及42℃生长试验等初筛,再用Vitek-32型微生物分析仪进行菌株鉴定,采用K-B法进行药敏试验,依照CLSI2012年版标准判读结果,其中头孢哌酮-舒巴坦的折点参考头孢哌酮的标准。定义多重耐药1.4头孢西丁胶片的裂隙试验用反复冻融法提取酶粗提液,按K-B法制备MH琼脂平板,涂布敏感菌株大肠埃希菌ATCC25922(一维),在平板中央贴上头孢西丁(30μg)纸片(二维),从距离纸片边缘5mm处用无菌手术刀片在平板的琼脂上离心方向切一长15mm、宽3mm的裂隙(三维),一块平板切4条裂隙,然后在裂隙中加入30μL酶粗提液(注意不能溢出),35℃孵育18~24h后阅读结果,若在裂隙与头孢西丁纸片交界处出现指向纸片的矢状细菌生长区域,为三维试验阳性,表明待检菌产AmpC酶。1.5亚胺培南胶片的安装0.5麦氏单位的待检菌按K-B法涂布于MH琼脂平板,贴上一张亚胺培南纸片(10μg),并在距离亚胺培南纸片边缘10~15mm处贴一张无菌空白纸片,再在空白纸片上滴加0.5mol/L的EDTA-Na1.8细菌总氮的提取按照Eastep通用型总RNA提取试剂盒(Promega公司)操作说明进行,用紫外分光光度计测定A1.9逆转录em参照GoScriptTMReverseTranscriptionSystem(Promega公司)操作说明进行,逆转录反应条件为70℃变性5min,25℃退火5min,42℃延伸1h,最后70℃灭活逆转录酶15min。以cDNA为模板进行PCR反应。目的基因adeB及内参基因recA引物见表1。2结果2.1耐药率的分析CRAB的耐药性非常严重,对12种抗菌药物中的9种耐药率>90%,其中对哌拉西林、头孢他啶、哌拉西林-他唑巴坦和美洛培南的耐药率均为100%;耐药率最低者为头孢哌酮-舒巴坦(44.0%),其次是米诺环素(67.9%)。84株CRAB全部表现为多重耐药性(表2)。2.2-内酰胺酶表型检验的结果三维试验检测发现83株(98.8%)CRAB产AmpC酶;EDTA协同试验未检测出产金属β-内酰胺酶的菌株。2.3bloaxa-24基因多态性和双重性84株CRAB经PCR检测,所有菌株都携带blaADC型AmpC酶基因;4种OXA型碳青霉烯酶基因中,全部菌株blaOXA-23、blaOXA-51基因均为阳性(图1),1株blaOXA-58基因扩增阳性(图2),未扩增出blaOXA-24基因;6种金属β-内酰胺酶基因(blaIMP-1、blaIMP-2、blaIMP-4、blaNDM-1、blaSIM-1及blaVIM-2)扩增均为阴性。随机抽取10株blaADC基因PCR阳性产物双向测序,DNA序列结果与GenBank中的EF569589.1比较,同源性达98%以上。随机抽取10株blaOXA-23基因PCR阳性产物双向测序,DNA序列结果与GenBank中的GQ861439.1比较,同源性达99%以上。84株blaOXA-51基因PCR阳性产物全部双向测序,DNA序列结果与GenBank中的AJ309734.2比较,同源性达98%以上。1株blaOXA-58基因阳性产物测序,DNA序列结果与GenBank中的AY665723.1比较,同源性96%。2.4adeb基因检测84株CRAB中,全部菌株经PCR均扩增到外膜蛋白carO基因,仅1株未扩增到外排泵adeB编码基因,阳性率98.8%,4株敏感株均扩增出adeB基因。68株和57株扩增到外排泵调控基因adeS和adeR,阳性率分别为81.0%、67.9%。随机抽取5株carO基因PCR阳性产物双向测序,DNA序列结果与GenBank中的DQ642021.1比较,同源性达95%以上。分别随机抽取5株adeB、adeS和adeR基因PCR阳性产物双向测序,DNA序列结果与GenBank中的AF370885.1比较,同源性达95%以上。2.5r-pcr检测结果在84株CRAB中随机选取10株(一株adeB基因阴性除外),以及4株敏感株(编号S2.6携带类整合子的检测69株I类整合酶基因(intI1)扩增阳性,提示这些菌株携带Ⅰ类整合子,检出率为82.1%。84株CRAB全部检测到插入序列ISAba1。3类整合子基因检测此次调查结果显示,CRAB耐药性非常严重,84株CRAB均为多重耐药株,12种临床常用抗菌药物中有9种耐药率>90%,对哌拉西林、头孢他啶、哌拉西林-他唑巴坦、美洛培南的耐药率最高,均为100%耐药;对头孢哌酮-舒巴坦耐药率最低(44.0%),与有关文献报道一致鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制较复杂,通常有多种机制共同参与,主要包括染色体介导的非诱导型高产AmpC酶在鲍曼不动杆菌的多重耐药以及对β-内酰胺类抗生素的交叉耐药中具有重要意义,因有别于其他AmpC酶,将其命名为ADCβ-内酰胺酶(ADC为acinetobacter-derivedcephalosporinases的缩写,是不动杆菌所产的头孢菌素酶),其编码基因blaADC尚未在其它细菌中发现细菌外膜构成半透性的屏障,不动杆菌的外膜通透性极低,仅为大肠埃希菌的1%~3%,这是其对多种抗生素天然耐药的重要原因之一AdeABC是鲍曼不动杆菌中最早发现的RND家族外排泵,其底物广泛,对氨基糖苷类、四环素类、红霉素类、氟喹诺酮类、β-内酰胺类、氯霉素和甲氧苄啶等抗菌药物及染料均有外排作用。外排泵编码基因adeB位于鲍曼不动杆菌的染色体上,外排泵调控基因adeS和adeR位于adeB基因上游,分别编码感应激酶AdeS和反应调节蛋白AdeR,这两种蛋白组成调控系统控制外排泵的表达整合子和插入序列等可移动遗传元件可在同种细菌或不同细菌之间转移,从而使其所携带的耐药基因快速传播。其中以Ⅰ类整合子在临床菌株中最常见。本研究在69株CRAB中检出了Ⅰ类整合酶基因(intI1),表明82.1%的菌株携带有Ⅰ类整合子,在后续的试验中,我们将对整合子可变区的基因盒进行检测以研究其所携带的耐药基因的情况。转座子和插入序列因为自带启动子可导致下游的耐药基因高表达综上所述,南昌地区CRAB耐药情况严重,产OXA-23型碳青霉烯酶是本地区鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素最主要的耐药机制,同时合并有外排系统的高表达及整合子、插入序列等可移动遗传元件的共同作用,导致菌株的多重耐药。1.6dna模板的制备采用煮沸法提取细菌基因组DNA。将-80℃保存菌株复苏传血平板,挑取过夜纯培养菌落3~4个,加入内含100μL无菌三蒸水的离心