荧光显示细胞器和细胞凋亡课件

荧光显示细胞器和细胞凋亡荧光显示细胞器和细胞凋亡荧光显示细胞器和细胞凋亡细胞器的荧光标记熟悉荧光标记各种细胞器的常用方法及原理掌握荧光显微镜下各种细胞器的形态及分布膜相结构细胞膜核被膜线粒体内质网高尔基体溶酶体过氧化物酶体非膜相结构细胞骨架微管微丝中间纤维核骨架，核纤层细胞结构染色质，染色体，核仁，核糖体荧光显示细胞器和细胞凋亡荧光显示细胞器和细胞凋亡荧光显示细胞1荧光显示细胞器和细胞凋亡课件2荧光显示细胞器和细胞凋亡课件3荧光显示细胞器和细胞凋亡课件4荧光显示细胞器和细胞凋亡课件5FluorescentDye

Excitation（激发频谱，nm）

Emission（发射频谱，nm）BODIPY®530/550

530

550

Dil

549

565

BODIPY®TMR

542

568

BODIPY®558/568

558

568

BODIPY®564/570

564

570

Cy3TM

550

570

TRITC

547

572

MagnesiumOrangeTM

550

575

Phycoerythrin,R&B

565

575

RhodaminePhalloidin

550

575

CalciumOrangeTM

549

576

PyroninY

555

580

RhodamineB

555

580

RhodamineRedTM

570

590

Cy3.5TM

581

596

ABI,ROX

588

608

CalciumCrimsonTM

590

615FluorescentDye

Excitatio6FluorescentDye

Excitation（激发频谱，nm）

Emission（发射频谱，nm）

TexasRed®

595

615

NileRed

549

628

YO-PROTM-3

612

631

YOYOTM-3

612

631

R-Phycocyanin

618

642

C-Phycocyanin

620

648

TO-PROTM-3

642

660

TOTO®-3

642

660

DiDDilC'(5)

644

665

Cy5TM

649

670

Thiadicarbocyanine

651

671

Cy5.5

675

694FluorescentDye

Excitatio71.细胞核的荧光显示P60-62吖啶橙（AcridineOrange)吖啶衍生物之一，它既可嵌入DNA双链间与双链DNA结合，经蓝光激发后发出亮绿色荧光，又可以静电堆积的方式与单链DNA或RNA的磷酸根结合，蓝光激发下发出橘红色荧光，从而清晰的显示DNA,RNA。异染色质（核内深染）和常染色质（核内浅染）1.细胞核的荧光显示P60-62吖啶橙（Acr8实验方法:P621.将生长有培养细胞的盖玻片（注意细胞面向上）置于一次性小培养皿内，加入95％乙醇固定15－30分钟，取出自然干燥；2.加入1％醋酸酸化30秒；3.在盖玻片标本上滴加0.01％吖啶橙染液，染色5－10分钟；4.去染液，用磷酸缓冲液冲洗1分钟；5.用1/10氯化钙分化30秒－3分钟；6.用PBS漂洗玻片3次，每次数秒；7.临时封片：滴1－2滴PBS于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观察。实验方法:P621.将生长有培养细胞的盖玻片（注意细胞面9细胞核呈绿色（DNA),细胞质呈橙红色。细胞核呈绿色（DNA),细胞质呈橙红色。102.线粒体的荧光标记P70罗丹明123－－特异性的线粒体荧光染料,是膜电位敏感的阳离子荧光素，活细胞线粒体具有大量质子积累造成的外正内负跨膜电位，吸引染料并将它保持在线粒体中,经蓝光激发,呈现黄绿色荧光.可作为线粒体膜电位的灵敏指示.罗丹明123结构式2.线粒体的荧光标记P70罗丹明123－－特异性的线粒体荧11电子传递和氧化磷酸化的偶联电子传递和氧化磷酸化的偶联12实验方法:P71取出已培养好细胞的盖玻片，用PBS(+)冲洗3次，每次漂洗浸泡2--3分钟，2.加入罗丹明123标记液，37℃培养箱孵育15分钟，3.吸去标记液，PBS液洗3次，每次3--5分钟，4.临时封片：滴1－2滴缓冲液于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观察。实验方法:P71取出已培养好细胞的盖玻片，用PBS(13细胞核附近发绿色荧光的圆形或短杆状颗粒即为线粒体细胞核附近发绿色荧光的圆形或短杆状颗粒即为线粒体143.内质网的荧光标记P64-671.材料培养细胞爬片2.试剂储存液：0.5mg/mLDIO-C6(3)存储液，4℃避光，标记液：2.5ug/mLDIO-C6(3)，4℃避光。0.5%戊二醛3.内质网的荧光标记P64-671.材料15实验方法:P67取出已培养好细胞的盖玻片，用0.5%戊二醛PBS溶液固定细胞10分钟，2.吸去固定液，用PBS液洗3次，每次漂洗时浸泡3--5分钟2.滴加DIO-C6(3)荧光染液，室温染色1分钟，3.吸去标记液，PBS液洗3次，每次5分钟，4.临时封片：滴1－2滴缓冲液于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观察。实验方法:P67取出已培养好细胞的盖玻片，用0.5%16荧光显示细胞器和细胞凋亡课件174.细胞凋亡细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmedcelldeath简称PCD），是由基因编程控制的细胞主动参与的自杀过程，是一种生理性调节机制，与细胞坏死的死亡机制是完全不同。细胞凋亡是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，在机体中承担着重要的调控作用。它不仅在维持细胞群体数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面，而且在肿瘤发生、发展、抗肿瘤药物的治疗等方面均具有十分重要的作用。4.细胞凋亡细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡18荧光显示细胞器和细胞凋亡课件19荧光显示细胞器和细胞凋亡课件20凋亡(Apoptosis)坏死(Necrosis)（1）定义：一种与遗传机制有关的(即由基因调控的)主动的、自发死亡的方式，无炎症反应。外在的致损伤因素作用达到一定强度，持续一定时间后所导致的细胞死亡（被动），有炎症反应。（2）形态学观察

细胞核：核浓缩、碎裂(染色质浓缩→有规律性、断裂成核碎片)，有新月形凋亡小体。细胞器：完整细胞膜：完好细胞体积：细胞浓缩在组织中：常呈单个细胞发生

核溶解(无规律的染色质团块→溶解)无规律性。崩解尚失去完整性细胞肿胀常成群细胞发生细胞凋亡与坏死的区别凋亡(Apoptosis)坏死(Necrosis)21（3）、生物化学检测核DNA有规律断裂50～300kb/或180bp左右的片断凝胶电泳：呈梯形条带(ladder)DAPI萤光染色，片状、颗粒状核荧光。流式细胞仪检测：可见亚G1峰(AP峰)核基因表达：必须DNA酶活性：必须蛋白激酶活性：必须细胞器环境：Na+/K+泵功能完好

DNA无规律地断裂条带不清（smears）无颗粒或片状核荧光出现无此峰——————功能丧失（3）、生物化学检测

22

细胞凋亡形态学观察荧光显微镜观察法－Hoechst33258染色法1.

材料：CHO细胞2.器材：细胞培养所需设备，荧光显微镜。

试剂(1)

细胞凋亡诱导剂：放线菌素D5mg粉剂用1mLDMSO（二甲亚风）浓度(5mg/mL)充分溶解，分装-20℃避光保存，(2)Hoechst33258染液：称取Hoechst332581mg,用20mL蒸馏水溶解，过滤，4℃避光保存。用时用蒸馏水10倍稀释成染色液，pH7.0(3)

固定液：4%多聚甲醛(4)

PBS液细胞凋亡形态学观察1.

材料23放线菌素D是一种抗肿瘤的抗生素类药物。通过脱氧鸟苷残基与DNA形成复合物，从而抑制DNA依赖的RNA聚合酶的活性，阻断转录过程。是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂.分子式:C62H86N12O16分子量:M.W.1255.5

溶解度:溶于DMSO,MeOH或CHCl3.，红色晶体。放线菌素D是一种抗肿瘤的抗生素类药物。通过脱氧鸟苷残基与DN24

操作方法

1.

贴壁细胞培养：将盖玻片置于小培养皿内，接种细胞培养过夜，2.

细胞换液并加入细胞凋亡诱导剂：放线菌素D2uL浓度(10ug/mL)继续培养24h，3.取出小培养皿，吸尽培养液，加入固定液(4%多聚甲醛)0.5mL固定10分钟，4.

去固定液，用PBS液洗2次，每次3分钟，洗涤时摇动，5.吸尽液体，将盖玻片正面向上放在载玻片中央，加入20uLHoechst33258染色液，染色5分钟，6.去染色液，盖玻片置于小培养皿内，用PBS液洗2次，每次3分钟，洗涤时摇动，7.

在载玻片中央加入1-2滴PBS液,将盖玻片反扣放在载玻片中央（长有细胞的面向下），尽量避免气泡产生，8.

荧光显微镜观察：350nm激发光观察，发射波长约460nm操作方法1.

贴壁细胞培养：将盖玻片置于小培养皿内，接种25活细胞呈均匀荧光，早期凋亡细胞：呈现细胞皱缩，胞膜完整，染质加深，或核染色质不均匀分布，呈聚集于核膜一边；晚期凋亡细胞：表现为核碎裂成大小不等的圆