鸡传染性支气管炎病毒ibv的分子流行病学和基因分析

鸡传染性支气管炎病毒ibv的分子流行病学和基因分析

聚合酶链反应（pcr）也称为外生基因扩张或无细胞克隆系统。自从1985年K.Mullis发明了PCR以来,该技术已广泛应用于分子生物学、基因工程、法医学、肿瘤学、传染病学、遗传学及农业科学等领域。在动物传染病研究中,与传统的检测方法如细菌学、病毒学和血清学方法等比较,PCR方法具有特异性和敏感性高、操作简便、快速高效等特点,因此应用广泛。引物设计是PCR技术中至关重要的一环,它决定着PCR扩增的特异性、扩增的效率和扩增的保真度等。本文结合多位研究者的实验结果和笔者的多年来在实验过程中对引物设计的一些经验体会,在此一并总结,供研究动物传染病及相关研究的同行参考。1预备工作启动前的准备工作1.1关于引物的基因在开始设计引物前要明确工作目的,首先要查阅足够的文献,了解所研究病原的各个基因的特性。比如是打算作病原的快速诊断还是作病原的分子流行病学或变异性分析?是鉴别不同血清型的病原或鉴别病原的强毒株与弱毒株或鉴别疫苗株与野毒株?或者扩增病原的全基因组?是否用于下一步克隆表达?为了达到以上研究目的应该选择哪段基因来设计引物?是扩全长还是部分基因?是扩编码区还是非编码区?这些问题在开始设计引物前必须弄清楚。动物传染病病原如病毒往往有多个基因,既有结构基因和非结构基因之分,结构基因和非结构基因又包括多个基因。如鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的编码结构蛋白的基因包括纤突(S)蛋白、膜(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白和E蛋白,其中S蛋白中的S1含有与病毒中和、血凝抑制抗体、细胞吸附、组织亲和性、毒力、血清型特异性有关的抗原位点,也是IBV蛋白中变异程度最大的结构蛋白;M蛋白比较保守,与抗原决定簇、抗感染、诱导白细胞产生α-干扰素等有关;N基因高度保守,在病毒的复制、装配、免疫中均起作用;E蛋白参与病毒的复制和感染细胞的细胞凋亡。如果是设计IBV通用诊断引物,应该选择高度保守的N基因来设计;如果要作分子流行病学或遗传变异性分析,应要选择高变的S1基因为扩增区域;如果要鉴别不同血清型的病原或鉴别病毒的强毒株与弱毒株或鉴别疫苗株与野毒株,应该选择在不同血清型或强毒株与弱毒株或疫苗株与野毒株的变异区域来设计。若扩编码区应将引物的位置定在启动子之前和终止密码之后。1.2基于组定位原理的cdna进行引物设计时模板选择有两种情况:一是扩增已知基因,这时需要在GeneBank数据库中搜索相同物种该基因的DNA或者mRNA为模板来设计引物,这简单容易。另一种是扩增未知基因,这时需要根据比较基因组定位的原理,选择研究深入的人或哺乳动物(如小鼠)保守的功能基因的DNA或者mRNA序列为模板来设计引物。在选择用来扩增来自不同物种DNA的引物时,应避开mRNA的5′和3′末端非翻译区序列,因为它们可能没有任何的同源性。若在cDNA序列内找寻PCR引物,需特别注意两点:首先,尽力将引物和产物保持在mRNA的编码区域内,因为这是生成蛋白质的独特序列,不像3′末端非编码区域与许多其他mRNA有同源性;第二,尽力把引物放在不同的外显子上,以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。若PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列,产物的大小是根据具体应用预选的。2引用设计2.1引物功能鉴定引物设计的三条基本原则:引物与模板紧密互补;引物与引物避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不能与模板的非目的位点发生错配。具体实现这三条基本原则需考虑如下因素:引物长度、产物长度、序列Tm值,引物与模板形成双链的内部稳定性、形成引物二聚体及发夹结构的能值、在错配位点的引发效率、引物及产物的GC含量,必要时还需对引物进行修饰,如增加酶切位点,引进突变等。具体来说,要遵循下面的原则。(1)引物应在保守区内设计并具有特异性。同时应预测扩增的片段单链是否形成二级结构。某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。(2)引物所在的模板区域应该位于外显子区,最好跨越一个内含子区,这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。(3)引物长度一般在16~30碱基(bp)之间,常用的是18~27bp,但不应大于38bp。每增加一个核苷酸,引物特异性提高4倍。太短易形成错配,降低特异性;过长会导致其延伸温度大于74℃,超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性并且降低产量。(4)G+C含量在40%~60%之间,过高或过低都不利于引发反应,上下游引物的G+C含量不能相差太大。(5)四种碱基要随机分布,不要有连续3个以上碱基存在,尤其3′端最后5个碱基最好不要富含GC,特别是连续3个的G或C,因这样会使引物在富含GC区错误引发。(6)引物自身不能有连续3个以上碱基的互补,否则引物自身会折叠成发夹结构形成引物本身复性。这种二级结构会因为空间位阻而影响引物与模板的复性结合。(7)两引物之间不应互补,尤其是它们的3′端以免产生引物二聚体;一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。(8)引物与非特异性靶区的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基的同源。(9)两引物间的Tm值越近越好。引物5′端的Tm值一般应高于3′端。(10)DNA双链所形成的自由能ΔG应该从5′端向3′端递减,3′端最好不要高于9kcal/mol。(11)引物3′端最后一个碱基要避开密码子的第3位。由于碱基的摆动,大多数密码子具有兼并性,编码同一氨基酸的第3个碱基可以有差异,会影响扩增的特异性和效率。故引物3′端最后一个碱基应该选在密码子的第1个或第2个核苷酸上。(12)引物3′端不可修饰,因为引物延伸是从3′开始。3′端不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位为A的错配效率明显高于其他3个碱基,故避免在引物的3′端使用碱基A。(13)引物5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增的特异性影响不大。因此引物5′端可以修饰(酶切位点、标记、突变位点、启动子序列、蛋白质结合DNA序列)。由于各种模板不同导致引物设计难度不一。注意的是,有的模板本身GC含量偏高或偏低,或者连续多个碱基,很难找到各种指标都十分合适的引物;在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。2.2在自动搜索和分析评价方面的应用设计引物的软件一般具备有引物的自动搜索功能和引物分析评价功能。引物的自动搜索功能,各种软件在这方面的侧重点不同,因此自动搜索的结果也不尽相同。自动搜索功能以“PremierPrimer”为最强且方便使用,“Oligo6”其次,其他软件如“VectorNTISuit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能,但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物,在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。在引物分析评价功能方面,以“Oligo6”最优秀。引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用,以“Premier”进行自动搜索,“Oligo”进行分析评价,即可快速设计出高成功率的引物。2.3引用层设计方法2.3.1计算机软件设计“PrimerPremier5.0”和“Oligo6”是经常使用的两个软件,这两个软件具体使用技巧和操作方法详见文献介绍。2.3.2网络strace-rope2。除此以外,还有如下网上设计引物的网址:(3)TheGPRIMEPackage(http://life.anu.au/molecular/soft-ware/gprime.htm)(4)WWWGenefisher(http://bobiserv.techfak.unibielefeld.de/genefisher/)(5)WebPrimers(http://alces.med.umn.edu/webprimers.html)(6)ProjectDOPE2(http://dope.ineractiva.de/)(8)http://labtools2.4修改引物质量上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改,包括检查有无引物二聚体、检查是否形成发夹结构、检查GC含量和Tm值、检查错配位点的引发效率,具体如下。(1)聚体的能值上游或下游引物自身或者上下游引物之间均可形成引物二聚体。二聚体形成的能值越高,越不符合要求。如果不是为了克隆,一般的检测性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。(2)引物的细度与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好。一般来说以不超过4.5为好。在设计克隆目的的PCR引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构,而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果,对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。(3)退火温度的确定GC含量以40%~60%为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高,导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近,以有利于退火温度的选择。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。为获得最佳结果,两个引物应具有近似的Tm值。(4)错配引发效率引物在错配位点的引发效率比较高,就可能出PCR假阳性。在普通PCR中,如果错误引发效率在160points