脑源性神经营养因子在细菌性脑膜炎炎症细胞中的表达

脑源性神经营养因子在细菌性脑膜炎炎症细胞中的表达

脑源性神经营养因子（nbu）在中枢神经系统的发育过程中起着重要作用，包括调节神经的生存、生殖、成熟和再生。它也是维持神经系统存活和正常生理功能的必要因素，以促进神经损伤后的再生。BDNF的最适配体为TrkB受体,BDNF与TrkB受体结合并激活酪氨酸激酶,从而激发细胞内各种信号转导,发挥生物学效应。BDNF对免疫的调节作用日益受到关注,在炎症损伤情况下,仅偶有报道散发性脑白质病变和多发性硬化患者脑组织内渗出的炎症细胞有高表达的BDNF,然而BDNF和TrkB在细菌性脑膜炎渗出的炎症细胞中的表达尚不清楚。本研究通过建立3周龄大鼠细菌性脑膜炎模型,探讨BDNF和受体TrkB在幼年大鼠细菌性脑膜炎炎症细胞中的表达,这对于深入研究BDNF在急性细菌性脑膜炎时的免疫作用有着十分重要的意义。1材料和方法1.1cif/l肺炎链球菌Ⅲ型菌株(31003-16)购自北京中国药品生物制品鉴定所,接种于血琼脂糖培养液,在37℃5%CO2环境中生长过夜,再移种于VITALAER肉汤里,生长至对数生长中期收菌,用生理盐水冲洗2次,再稀释成1010cfu/L。1.2肺炎球形细菌感染大鼠wbc后分离培养取自浙江大学医学实验动物中心3周龄SD大鼠16只,雌雄不限。随机分成两组,感染组10只,对照组6只。用10%水合氯醛0.15~0.3ml/100g体质量静脉注射麻醉后,固定于立体定位仪。脑膜炎的诱导参照李玲等方法,脑池穿刺,移去50μl脑脊液,感染组注入肺炎链球菌菌悬液50μl,对照组注射生理盐水50μl。置笼中于室温23℃,明暗各12h,自由饮食。接种后24h,取脑脊液50μl计数白细胞(WBC)。感染组大鼠感染前脑脊液WBC为(54.06±37.09)×106/L,主要为淋巴细胞,感染后为(4321.24±1230.72)×106/L,主要为中性粒细胞,WBC感染后较感染前明显升高(F=84.96,P<0.01)。对照组大鼠脑脊液WBC注射前(53.76±32.19)×106/L,注射后(56.01±35.37)×106/L,均以淋巴细胞为主,注射前后无明显变化(F=0.09,P>0.05)。感染组大鼠感染前脑脊液培养无细菌生长,感染后脑脊液培养出与接种同株的肺炎链球菌。对照组大鼠注射前后脑脊液培养均无细菌生长。1.3海马冠状面冷冻切片两组大鼠经主动脉灌流0.1MPBS及4%多聚甲醛,剥离脑组织,再浸入4%多聚甲醛4℃后固定4h,移入30%蔗糖溶液中直至组织块沉下,速冻,经海马冠状面冷冻切片,免疫组化30μm,原位杂交15μm,贴于经赖氨酸预处理的玻片,吹干。1.4晶美生物工程有限公司兔抗大鼠单克隆抗体BDNF(美国Chemicon产品)购自晶美生物工程有限公司。免疫组化二步法染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司,二步法染色按试剂盒说明进行。用PBS替代特异性抗-BDNF抗体作为阴性对照。1.5检测试剂盒BDNF及其受体TrkB地高辛标记的寡核苷酸探针和原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司,原位杂交检测按试剂盒说明进行。用PBS代替探针做杂交阴性反应对照。2结果2.1叛乱分子的出现感染后24h大鼠软脑膜、蛛网膜下隙及脑室内渗出的炎性细胞可见BDNFmRNA阳性杂交信号(图1),对照组未见炎性渗出(图2)。2.2cnf蛋白在炎症细胞中的发现感染后24h大鼠软脑膜、蛛网膜下隙、脑室内渗出的炎性细胞均有较强的阳性染色颗粒(图3)。对照组未见炎性渗出。2.3trb受体mrna对炎症细胞的表达感染后24h大鼠软脑膜、蛛网膜下隙、脑室内渗出的炎性细胞可见TrkBmRNA阳性杂交信号(图4),对照组未见炎性渗出。3细菌fig和trkb的相互作用BDNF是神经营养因子家族成员之一,对神经元的可塑性、存活以及调节神经递质的释放和树突的生长发挥着至关重要的作用。在各种病理损伤状态下,BDNF能够防治神经轴索的损伤,这些作用影响着关键神经元的数量,包括感觉、小脑和脊髓神经元等。BDNF通过结合表达在神经元上的高亲和力受体TrkB发挥其生物学效应,BDNF也通过结合截断型TrkB受体调节星形胶质细胞的功能。BDNF主要来自中枢神经系统的神经元,全长型TrkB受体仅表达在神经元上。细菌性脑膜炎时,除神经元表达BDNF蛋白、BDNF和TrkB基因外,蛛网膜下隙、脑室内渗出的炎症细胞不仅高表达BDNF蛋白、BDNF基因,而且同时表达TrkB基因。这一结果提示,炎症细胞表达BDNF及BDNF和TrkB基因可能是对细菌侵入的反应,炎症渗出既可由BDNF介导产生神经保护作用,同时炎症细胞也是BDNF的靶细胞,在细菌性脑膜炎时,BDNF可能参与调节免疫反应,进一步证实,BDNF同时作用于神经系统以外的免疫组织。已有的研究认为,在细菌性脑膜炎形成过程中,细菌及其产物进入蛛网膜下隙后,刺激中枢免疫细胞表达细胞因子和炎症前分子,形成一个复杂的炎症反应。肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素1(IL-1)作为先驱因子协同触发一系列的炎症递质,包括IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等细胞因子,化学因子,血小板活化因子,前列腺素,基质金属蛋白激酶等,这些炎症递质在细菌性脑膜炎病理生理的发展以及脑损伤的形成过程中都发挥了各自重要的作用,并相互影响,这一炎症反应决定着细菌性脑膜炎的预后。由此,一直以来采用减轻炎症反应的治疗策略来防治细菌性脑膜炎的神经系统后遗症,尽管新的强有力的抗生素不断问世和应用,但近十年来,细菌性脑膜炎神经系统后遗症的发生率仍居高不下。我们先前的实验研究发现,肺炎链球菌脑膜炎动物经抗生素治疗后BDNF表达明显降低,皮层、海马存活神经元明显减少,补充外源性BDNF辅佐治疗后,皮层、海马存活神经元数明显增多。这些研究结果表明,在细菌性脑膜炎时,炎症细胞表达BDNF,证实炎症反应和炎症细胞渗出不仅是有害的,也是有利的,神经营养因子与TNF-α、IL-1β等炎症递质可能是细菌性脑膜炎炎症反应过程中,既有保护又有破坏作用的两个系统,共同影响着病情发展的势态。对于免疫细胞是否表达TrkB受体,国际上还有争议。有研究报道,在人和鼠淋巴组织和免疫细胞中发现TrkB受体。一些体外实验也发现人B和T细胞中表达TrkBmRNA及其蛋白,但也有研究报道,在体外培养的T细胞和多发性硬化活检脑组织里未发现TrkB的表达。我们的实验证实,细菌性脑膜炎时,渗出的炎症细胞不仅表达BDNF基因及其蛋白,还同时表达TrkB受体,提示炎症细胞也是BDNF的靶器官,BDNF对炎症细胞的功能究竟有什么样的作用,BDNF如何通过TrkB介导的细胞内信号传导调节免疫功能或免疫反应尚不清楚