alk、ros1、re基因在非小细胞肺癌中的研究进展

alk、ros1、re基因在非小细胞肺癌中的研究进展

肺癌是世界上癌症死亡的主要原因。目前，非小细胞肺癌（非小细胞肺癌）的分子靶剂是研究的重点。对于具有不同基因的egfr和alk基因的特定基因基尼、奥洛西韦和克什罗西韦尼目前主要用于非小细胞肺癌的临床治疗。酪氨酸融合激酶是白血病以及实体瘤癌基因的一种重要亚型,1960年Ph染色体(BCR-ABL融合基因是最早发现的累及受体酪氨酸激酶而致病的重组基因,伊马替尼针对BCR-ABL融合基因的靶向治疗在慢性髓性白血病治疗领域获得巨大成功,使其成为靶向治疗最成功的范例。随着融合基因的不断发现,我们对融合基因的关注不仅仅局限在血液病,更多的实体瘤也被融合基因驱动,本文就NSCLC中发现的ALK、ROS1、RET等融合基因进行综述。1alk融合基因1.1eml4-alk融合基因2007年,日本学者Soda等通过cDNA文库筛选在肺癌中发现棘皮动物微管样蛋白4-间变淋巴瘤激酶(echinodermmicrotubuleassociatedproteinlike4-anaplasticlymphomakinase,EML4-ALK)融合基因,这是继EGFR、k-ras基因之后在NSCLC中新发现的具有靶向药物的肿瘤生物标志,EML4-ALK融合型肺癌的发生发展对该融合基因具有高度依赖性。位于2号染色体上的EML4基因断裂后与同一染色体上断裂位点相对保守的ALK基因的20外显子发生融合,从而形成EML4-ALK融合基因inv(2)(p21p23),融合后的EML4启动子可以驱动EML4-ALK转录活化表达融合蛋白。已发现的融合方式有10多种,其中以V1(EML4的13外显子断裂)和V3变体(EML4的6外显子断裂)最常见,并且不断有新的EML4-ALK的融合变体被报道,如E20、ins18A20等。ALK还可以与其他基因融合为TFG-ALK和KIF5B-ALK等,这些新型融合基因的发现进一步确定了在NSCLC中ALK异常的重要作用。本课题组采用PCR产物克隆测序方法分析3例ALK融合阳性患者样本,检测到在同一样本中可潜在并存多种EML4-ALK融合序列变体,证明在同一肿瘤标本中EML4-ALK融合基因可存在多种融合方式,提示EML4-ALK融合基因存在序列的多样性与复杂性。目前针对EML4-ALK融合基因的检测方法主要有荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)及基于PCR的分析技术。这些方法各存在优缺点,在实际临床应用中可能存在联用的互补性。在检测到含有EML4-ALK融合基因的肿瘤标本中,建议将PCR产物进一步进行分子克隆,以便在同一肿瘤组织样本中发现是否含有多种不同的EML4-ALK变体共存,从而为患者的个体化治疗提供更多的信息。1.2eml4-alk融合变异肺癌的耐药ALK融合活化可致细胞恶性转化,临床研究表明肿瘤标本中检测到含有EML4-ALK的NSCLC患者可从ALK特异性激酶抑制剂克唑替尼中获益,显著延长患者的总生存期,并已于近期获FDA批准治疗ALK阳性的晚期NSCLC患者。一项回顾性研究报道,进展期NSCLCALK基因重排的患者经克唑替尼治疗后与ALK基因重排未服克唑替尼者比较,可明显改善生存率,但是比较36例未服克唑替尼的ALK重排的患者与253例野生型患者的生存率相似,表明ALK重排不是一个有利的预后因素。但经克唑替尼治疗的患者1年内易发生获得性耐药,有研究报道ALKTK结构域的L1196M、C1156Y位点突变与EML4-ALK融合变异肺癌患者服用克唑替尼治疗后的耐药相关。热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)HSP90抑制剂能快速降低患者肿瘤组织中EML4-ALK的水平而缓解肿瘤的进展,并且发现在使用ALK抑制剂克唑替尼后获得性耐药的患者再用第2代的ALK抑制剂或者HSP90抑制剂治疗是有效的。针对ALK变异型肺癌的个体化治疗正在不断发展,不同的融合方式产生的酪氨酸激酶活性不同,导致从ALK-TKI中获益的程度可能不同。因此,了解EML4-ALK融合基因在NSCLC中的融合方式,对于疗效预测和分子诊断具有重要意义。2罗斯1基因融合2.1ros基因的基因组织人类ROS1基因是胰岛素受体家族的一种跨膜酪氨酸激酶,与禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具有同源性,因此被命名为ROS基因,之前也称为c-ros-1、mcf3基因,ROS1基因位于6q22染色体,含7368bp和43外显子,与v-erbB、v-fms、neu和trk原癌基因相似。ROS1基因由一个酪氨酸激酶区域、一个跨膜区域和一个含N端糖基化位点的细胞外区域组成,编码具有酪氨酸激酶活性的Ⅰ型完整膜蛋白,其配体未知。ROS基因最显著的特征在于细胞外区域由6个重复序列组成,与纤维连接蛋白具有高度同源性,而纤维连接蛋白是一种细胞外基质和血浆蛋白,在细胞黏附中伴有重要作用。但是ROS基因不同于普通的细胞黏附分子,类似于Ⅲ型重复纤维连接蛋白的氨基酸序列(其他酪氨酸激酶少见)以及其细胞内的激酶活性,使它可以直接翻译黏附分子参与细胞内的信号通路。神经母细胞瘤细胞株SW-1088的ROS1cDNA长8.3kb,编码相对分子质量为259×103的跨膜酪氨酸蛋白,检测45种人类正常或肿瘤细胞株,发现在56%神经母细胞瘤细胞株中ROS1基因高表达,而且正常人脑组织和神经胶质细胞中无表达,表明ROS1基因可影响细胞的生长和分化。生物芯片分析致癌因素诱导小鼠肺癌显示,ROS基因的表达比正常肺组织增加3倍,其在肺癌早晚期的升高表明ROS基因对肺癌的发生发展有重要作用。2.2ros1融合氨基酸激酶活性ROS1基因发生重排时丢失细胞外区域,保留跨膜和细胞内酪氨酸激酶区域,重排位点主要发生在ROS1基因的32-36外显子。关于ROS1基因最初在神经母细胞瘤中发现高表达并与FIG基因(细胞株U-118MG)发生重排,ROS基因在其他肿瘤中也被发现重排,胆管癌酪氨酸激酶的调查显示,ROS激酶活性在胆管癌中的发生率为8.7%(2/23),进一步采用5′RACEPCR检测显示2例为不同融合方式的FIG-ROS基因(F3;R36和F7;R35)。2007年Rikova等发现ROS1融合基因也在肺癌HCC78细胞株(SLC34A2-ROS1,S4;R32和S4;R34)以及NSCLC患者标本(CD74-ROS1,C6;R34)中表达。采用FISH检测发现1073例肿瘤样本中,18例(1.78%)有ROS1基因的重排,32例(2.98%)有ALK基因的重排,对18例FISH检测ROS1阳性的样本进一步采用RT-PCR检测,发现6例为阳性,其中5例的融合方式为C6;R34,1例为S4;R32。在202例未吸烟的肺腺癌亚洲患者样本中,采用多重PCR检测ROS1基因与CD74、SLC34A2基因的融合,结果检测到2例含有ROS1基因的融合(0.99%),2例均为Ⅲ期的女性患者,融合方式为CD74-ROS1,1例为C6;R34,在另1例患者样本中发现C6;R34与C6;R32共存,未发现有与SLC34A2基因的融合。但采用Q-PCR检测这2例融合基因样本的ROS1基因的表达并没有升高,ROS1基因mRNA表达水平是否作为融合的预测指标还需要进一步研究。经分子和组织病理学检测1476例肺癌患者ALK和ROS1融合基因,13例(0.88%)ROS1阳性,其中SLC34A2-ROS1(1例),SDC4-ROS1(3例),CD74-ROS1(3例),TMP3-ROS1(2例),EZR-ROS1(2例),LRIG-ROS1(1例),1例未知。ROS1融合酪氨酸激酶活性在神经母细胞瘤、胆管癌以及肺癌中的发现显示,在癌症中需进一步检测ROS1基因是否发生融合以及ROS1激酶的活性。在NSCLC中ROS1基因主要与SLC34A2、CD74发生融合,ROS基因的跨膜区域由Exon35-Exon36编码,有趣的是每种融合方式都含有2个跨膜区域。SLC34A2属于溶质转运蛋白家族SLC34的成员之一,编码钠依赖磷酸盐运输蛋白2B(NaPi2b),在小肠、肺、肝、乳腺等组织中表达并认为与细胞分化相关。采用实时定量PCR(real-timequantitativePCR,RT-qPCR)比较乳腺癌及其癌旁组织中SLC34A2的表达,发现SLC34A2在癌组织中高表达,并且其与肿瘤标志物CA125的高表达具有相关性,表明SLC34A2可以作为乳腺癌诊断和靶向治疗的一个生物标志。在卵巢肿瘤中定量分析SLC34A2的表达情况,发现其与低分化的子宫内膜癌相比,在分化好的浆液性乳头状卵巢癌和子宫内膜癌中高表达,提示SLC34A2基因的表达可以预测卵巢癌的分化状况,可以作为诊断和预后的标志物。SLC34A2基因在肺中强表达并分布在肺泡Ⅱ型上皮细胞的顶端,但有采用抑制性消减杂交技术以及RT-PCR检测SLC34A2基因在NSCLC中的表达与正常组织和癌旁组织相比是下降的。CD74是巨噬细胞迁移抑制因子的受体,是一种完整的跨膜蛋白,也被称为MHC-Ⅱ类分子恒定链,在体内广泛表达并发现在多种恶性肿瘤细胞广泛表达。在NSCLC中SLC34A2、CD74的表达是否与ROS1基因发生融合相关还有待进一步研究。2.3alk激酶抑制剂ROS1融合基因确定为NSCLC细胞株的驱动基因,这种融合可导致持续性的酪氨酸激酶活化,并与TKIs药物的敏感性有关。因为ROS1与ALK的激酶区域有同源性(49%),研究表明几种ALK抑制剂可以抑制ROS1激酶的活性。表达FIG-ROS的B3F细胞可被ALK激酶抑制剂TAE684复合物抑制,小鼠体内外试验也证明,转染ROS融合基因的3T3细胞具有成瘤性,且可被其激酶抑制剂抑制,表明ROS激酶可以作为胆管癌的一个分子诊断标志物以及靶向治疗的候选基因。在大规模的癌症细胞株中检测ALK激酶抑制剂TAE684复合物的活性,显示HCC78细胞株是10株最敏感的细胞株之一,其余9株为ALK基因的异位或扩增,ROS1融合基因与抑制剂TAE684有关表明其有酪氨酸激酶的活性。HCC78细胞株(含SLC34A2-ROS1)和转染了CD74-ROS1基因的293细胞对多靶点ALKMET激酶抑制剂克唑替尼敏感,且1例患者服用克唑替尼后显示肿瘤接近完全消失。克唑替尼已用于ROS1阳性的进展期NSCLC患者的Ⅰ期临床试验(NCT00585195),初步结果显示14例阳性患者在第8周时有效率和疾病控制率分别为57%和79%。3资源性融合不显著KIF5B-RET是NSCLC中新发现的一个融合驱动基因,为10号染色体上驱动蛋白家族基因KIF5B和受体酪氨酸激酶基因RET之间发生融合,Ju等对1例33岁、不吸烟患者的肺腺癌肝转移灶进行基因组和转录组测序发现了KIF5B-RET融合基因,进一步对20个肺腺癌样本进行定向测序分析发现2个病例中存在这一融合,且这种融合可导致RET原癌基因的高表达。Takeuchi等经分子和组织病理学检测在1526例肺癌患者样本发现14例(0.9%)腺癌存在新的融合基因KIF5B-RET和CCDC6-RET,而且RET基因的断裂位点相对保守,在14例阳性样本中有11例位于12外显子,1例位于11外显子,1例未知。Lipson等采用新一代测序检测40例直肠癌和24例NSCLC患者样本的145个癌症基因,在1例直肠癌患者中发现含有C2orf44-ALK融合基因,1例NSCLC患者中发现含有KIF5B-RET基因,进一步在561例肺腺癌中检测到11例(2%)含有KIF5B-RET基因。另有报道KIF5B-RET基因在肺腺癌的发生率为1%～2%,在7例RET融合基因阳性的样本中有6例位于12外显子,1例位于8号外显子,并证明RET激酶抑制剂凡德他尼(vandetanib)可抑制KIF5B-RET融合基因锚定的NIH3T3细胞的生长活性。4非全日制基因的特征4.1kif5b-ret融合基因的病例特征ALK融合基因的临床特征明显存在于腺癌、不吸烟、年轻患者的肿瘤样本中,且印戒细胞癌中多见。通过病例分析发现ROS1重排与ALK重排的患者特征较相似,也明显倾向更年轻、不吸烟、腺癌患者,但在印戒细胞癌中不常见,ROS1阳性的患者与ROS1阴性比较在总生存率上没有区别。目前所检测到含有KIF5B-RET融合基因的肺癌几乎均为腺癌,且在日本患者中检出的6例均为非吸烟腺癌。多元分析在1116例腺癌中检测到的71个融合基因,确定4个预后差的独立因素:年龄≥50岁、男性、高病理分期、激酶融合状态阴性。4.2ros融合基因的生物学作用生物芯片分析显示,每种白血病融合基因BCR-ABL、TEL-PDGFRB和TEL-JAK2可诱导或抑制800～2000个基因至少2倍的表达,而且其中许多基因被确定与细胞的迁移、增殖和分化有关,RT-PCR进一步分析显示,这3种融合基因可介导不同的基因调节,表明白血病中每种酪氨酸激酶染色体异位具有不同的生物学功能。FIG-ROS的转化作用需要通过FIG的第2个卷曲结构靶向到高尔基体上,用Myc-标记的ROS融合基因转染3T3细胞免疫荧光检测显示FIG-ROS定位在细胞质,而SLC34A2-ROS1定位在细胞核旁,并证明F3R36的激酶活性是F7R35的4倍,不同的ROS融合有不同的亚细胞定位,表明在体内它们有不同的活化功能。将不同的ALK融合变体(V1、V2、V3a和V3b)转染Ba/F3细胞证明各种不同ALK融合变体具有不同的融合蛋白稳定性,以及从ALK抑制剂克唑替尼和TAE684中获益的程度也不相同,其中V2变体的敏感性最高,这可能可以解释临床ALK抑制剂治疗ALK阳性肿瘤患者的异质性。目前进行临床试验的患者样本以FISH确定ALK的重排而未知具体的融合方式,可进一步通过能获得的样本进行RT-PCR检测,再结合前期的临床数据,可证实不同融合变体具有不同的靶向药物敏感性这一假设。4.3kif5b-ret、dcc6-alk1.3.3基因分析白血病常见的融合基因AML1-ETO﹑BCR-ABL﹑CBFb-MYH11、F2A-PBX1、MLL-AF4﹑PML-RARα﹑TEL-AML