两融合法筛选斑玉藓中漆酶的研究

两融合法筛选斑玉藓中漆酶的研究

蘑菇h.e.黑玉也被称为蘑菇。日本称为真菌属agal，属于伞菌属，属于蘑菇科ticholomatace，hypsizagus。这是一种稀有而珍贵的食品。在栽培生产中其生产周期较长(胡开辉等2009),菌体的生长速度较慢,抑制杂菌的能力较差,在一定程度上限制了真姬菇的推广生产(胡开辉和出小平2008)。漆酶最早发现于漆树,是一种含铜的酚氧化酶(Leatham&Slahanman1981)在菌体的生长过程中参与木质素的降解,可为菌体生长提供养料,在降解木质素的同时会产生酚类和醌类等抑制杂菌生长的化合物,可有效地抵抗杂菌的污染(Zhao&Kwan1999)。漆酶活性的高低可能与菌体的生长速度,生产周期有密切的关系,漆酶活性较高的菌种生长速度较快,生产周期相对较短(朱海潇2008)。食用菌育种研究已成为食用菌科技工作者关注的热点之一(马三梅等2004)。目前食用菌育种的主要目标是提高食用菌的品质和产量,而缩短生产周期和提高产量相结合的研究仅局限于栽培条件的改善,未能从根本上解决有些食用菌生产周期长的问题。食用菌主要育种方法有驯化育种、孢子分离育种、杂交育种、诱变育种及基因工程育种等(宋冬灵等2007),但每种方法都缺乏有效的筛选标记,造成选育新品种费时、费力、工作量大、周期长等问题(陈娟和苏开美2008)。漆酶具有降解木质素,氧化降解酚类物质,抑制杂菌,改善出菇品质等重要作用(周光龙和余大廷1992),但漆酶在食用菌育种中的研究未见有相关报道,本研究采用漆酶转化与原生质体融合相结合的技术,建立斑玉蕈育种中漆酶转化体系,将漆酶活性较高、生长速度较快、抗菌能力较强的凤尾菇(朱海潇等2008)原生质体灭活与具有活性的斑玉蕈原生质体融合,采用RB-PDA平板显色法筛选具有漆酶活性的融合菌株,并对其相关特性做了初步研究。该方法的建立对今后斑玉蕈育种及品质改良提供了一种新思路,对其他食用菌育种也具有一定的借鉴作用。1材料和方法1.1菌种igig、凤尾菇、pleurol-saravi斑玉蕈(真姬菇9600Hypsizigusmarmoreus)、凤尾菇Pleurotussajor-caju为本实验室保存菌种。1.2培养基和培养基PDA固体培养基:马铃薯20%,蔗糖2%,琼脂2%,pH自然。液体培养基:发干酵母粉0.5%,蛋白胨0.05%,蔗糖2%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.05%。再生培养基:蔗糖0.4mol/L,发干酵母粉0.5%,蛋白胨0.05%,琼脂下层用2%,上层用0.3%(彭卫红等2005)。RB-PDA亮蓝培养基:马铃薯20%,蔗糖2%,琼脂2%,pH自然,121℃高压灭菌20min备用。冷却至60℃左右时加入已灭菌的5mg/mL的RB亮蓝溶液适量,使培养基中RB亮蓝浓度为0.05%(W/V),混合均匀,倾倒平板(黄乾明2006)。1.3pcr反应溶壁酶液:溶壁酶(Lywallzyme)购于Sigma公司,用0.6mol/LMgSO4配制成2%(W/V)浓度的酶液,用0.22μm的滤膜除菌过滤器过滤除菌4℃保存备用。融合剂:25%(W/V)聚乙二醇(PEG)4000,CaCl2·H2O50mmol/L,甘露醇0.6mol/L,pH8.0。稳渗剂:0.6mol/L甘露醇。RB亮蓝溶液:RB亮蓝(RemazolbrilliantblueR)购于Sigma公司。称取适量RB亮蓝粉末配制成5mg/mL的溶液,121℃灭菌20min,备用。PCR反应所用的TaqDNAPolymerase,dNTPMixture,10×PCRBuffer,DNAMarker(DL2000)购自TaKaRa(大连)有限公司。引物均购自上海生工生物工程有限公司。1.4生长曲线法检测采用RB-PDA平板显色法检测漆酶活性,将凤尾菇和斑玉蕈分别由试管斜面转接到RB-PDA亮蓝培养基的平板中,25℃恒温培养,进行显色观察。1.5两种菇的酶解将斑玉蕈与凤尾菇分别由试管斜面转接至装有液体培养基的锥形瓶中25℃静置培养5-7d,在无菌的条件下切取菌块边缘幼嫩的菌丝并用无菌水洗涤3-5遍,用吸水纸吸去多余的水分然后称取200mg,将制备好的两种菇的菌丝体分别移入离心管中加入3mL质量分数为2%溶壁酶液在30℃水浴中酶解2.5-3.0h,每10min轻摇一次。经酶解处理而得的原生质体用稳渗剂洗涤2-3遍,然后离心去除稳渗剂和酶液,在光学显微镜下观察原生质体的形状,并用血球计数板计数。1.6斑玉蚤原生质体的复配取1mL制备好的凤尾菇原生质体于55℃水浴灭活处理45-50min,然后加入1mL具有活性的斑玉蕈原生质体和2mL融合剂于32℃水浴温育25-30min,离心去除融合剂,适当稀释至40倍光学显微镜下视野中3-5个原生质体为宜。然后分别吸取灭活的凤尾菇原生质体、具有活性的斑玉蕈原生质体及融合后的原生质体100μL在含有再生培养基的平板上涂布,于25℃恒温培养。1.7综合菌株筛选采用原生质体灭活和RB-PDA平板显色相结合的方法筛选融合菌株。1.8综合消毒1.8.1斑玉蚤、凤尾菇抗逆性测定采用两点接种法分别将融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A与斑玉蕈、凤尾菇接在同一含有PDA培养基的平板内,于恒温培养箱内25℃恒温培养,观察记录各菌株间的拮抗状况。1.8.2pcr扩增程序采用CTAB法,分别提取斑玉蕈、凤尾菇及融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A的基因组DNA,进行RAPD-PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳。25μLRAPD反应体系中含DNA模板1μL(30ng/μL)、10×PCRbuffer2.5μL、dNTP2μL(2.5mmol/L)、primer2μL(5μmol/L)、TaqDNA聚合酶0.2μL(5U/μL),加ddH2O到25μL。PCR扩增反应程序:94℃预变性5min;94℃变性1min,36℃复性2min,72℃延伸1min,40个循环;最后72℃延伸10min。取5μL扩增产物与1μLLoadingbuffer混匀上样,在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳,以0.5倍TBE为电泳缓冲液,110V电压下电泳1h,最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照并存盘。1.8.3pcr扩增检索漆酶基因,据检索到的基因序列设计并合成引物、进行PCR扩增、电泳分析,检测融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A基因组中是否已转入漆酶基因。漆酶基因PCR扩增的体系:25μL反应体系中含DNA模板1μL(30ng/μL)、10×PCRbuffer2.5μL、dNTP2μL(2.5mmol/L)、引物(LA:5′-GTCATGTTTCCAGGCGCACGG-3′;LB:5′-GGCCAGGCCTTAGGACGGAACGATG-3′)各2μL(5μmol/L)、TaqDNA聚合酶0.2μL(5U/μL),加ddH2O到25μL。扩增反应程序94℃预变性5min;然后94℃变性1min,55℃复性45s,72℃延伸45s,40个循环;最后72℃延伸8min。取5μL扩增产物与1μLLoadingbuffer混匀后上样,在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳,以0.5倍TBE为电泳缓冲液,110V电压下电泳1h,最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照并存盘,回收凤尾菇和融合菌株相同的特异条带并测序。1.9不同漆酶活性对酶活性的影响融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A三次试管传代后采用RB-PDA平板法测定其漆酶活性。为进一步检验融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A的遗传稳定性,对其进行了出菇试验,然后采用组织分离法获得纯培养菌种检测其漆酶活性,并提取其基因组DNA进行漆酶基因的PCR扩增。2结果与分析2.1a平板添加量的确定RB亮蓝是漆酶的一种底物,在漆酶的作用下颜色会由蓝色变为赤黄色。凤尾菇能使RB-PDA平板由蓝色变成赤黄色(图1),接种后2-3d接种块周围开始变色,变色圈直径大小与菌丝直径基本一致,说明凤尾菇漆酶活性较高。而斑玉蕈不能使RB-PDA平板变色,培养20d左右,菌丝长满整个平板后RB-PDA平板仍为蓝色没有发生变化,说明斑玉蕈不具有漆酶活性。2.2原生质体的测定取制备好的凤尾菇和斑玉蕈的原生质体在光学显微镜下观察,原生质体多成球状或近似球状,用血球计数板测得凤尾菇原生质体数为3.25×105个/mL,斑玉蕈原生质体数为1.32×104个/mL,达到了融合所需要的浓度。2.3原生质体的再生反应热灭活的凤尾菇原生质体和斑玉蕈原生质体各涂布10个平板,均没有形成菌落,说明灭活比较彻底,而没有灭活的凤尾菇和斑玉蕈原生质体在含有再生培养基的平板上形成了新的菌落,说明制备的原生质体具有再生的能力,每个平板涂布10-15个原生质体,斑玉蕈原生质体再生形成菌落生长的速度比凤尾菇慢(图2)。两菌种间菌落生长速度的差异和菌丝形态的差别,也可作为融合菌株筛选的参考依据。2.4漆酶基因型检测采用RB-PDA平板显色法筛选具有漆酶活性的融合菌株,将生长速度较快的单菌落融合菌株转接到RB-PDA平板上进行显色观察。融合菌株能使平板由蓝色变为赤黄色,说明漆酶基因已从凤尾菇基因组中转入斑玉蕈的基因组中并成功表达、分泌到培养基中作用于RB-PDA平板,使颜色发生变化(图3-A、C)。试验结果还表明变色明显的菌株菌丝较纯白、浓密、活力较强、生长速度较快,与亲本斑玉蕈相比具有一定的生长优势(图3-B、D)。不同融合菌株的显色时间及显色能力有较大的差异,通过对5次融合试验所得的融合菌株进行筛选比较,选出变色能力较强、生长速度较快的融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A。2.5菇两亲本间的抗逆性融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A与斑玉蕈和凤尾菇两亲本的拮抗现象明显,每两个菌株间均有拮抗线,而且两个融合菌株间也有拮抗线,说明这两个融合菌株并非同一菌种(图4)。2.6引物筛选及其扩增效果的表现从引物S10,S22,S23,S62,S1010,S2047中筛选扩增条带清晰,多态性丰富和重现性好的引物S1010,S22,S62,对凤尾菇、斑玉蕈及两融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A的基因组DNA进行扩增。3种引物所扩增的供试菌株的DNA片段数量及其分子量大小都有显著差别(图5),说明筛选的引物能正确地反映各菌株间的遗传差异。引物S1010、S22扩增结果表明,Ⅲ18C、Ⅲ2A与斑玉蕈的遗传差异较小(扩增出的DNA片段数目及对应片段分子量大小基本一致),与凤尾菇的遗传差异较大(扩增的DNA片段数目尤其是片段分子量差异明显)。而引物S62扩增结果显示,Ⅲ18C、Ⅲ2A不仅与凤尾菇的遗传差异较大而且与斑玉蕈也有显著的遗传差异(扩增的DNA片段数目明显多于两亲本而且出现了新的片段),说明两融合菌株的基因组已与两亲本不同,同时也证明了采用RB-PDA平板显色技术可以准确有效地筛选融合菌株。2.7dna模板的制备斑玉蕈没有扩增出条带,凤尾菇及两融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A均扩增出了条带(图6),阴性对照PCR体系中DNA模板用无菌蒸馏水代替。测序结果表明,片段长455bp,与Pleurotusostreatus相似性达60%,试验结果说明利用原生质体融合技术在凤尾菇和斑玉蕈间成功地实现了漆酶基因的转化,所筛选到的两融合菌株是具有漆酶基因的斑玉蕈新菌株,同时这也与本研究前期对凤尾菇和斑玉蕈漆酶活性测定的结果一致。2.8c、2纯培养菌株对rb-pda平板变色的pcr检测融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A经3次传代后仍能使RB-PDA平板变色,说明具有漆酶活性,试验结果与初筛一致。组织分离法获得的融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A纯培养菌种能使RB-PDA平板变色(图7),漆酶基因的PCR扩增结果与初次扩增结果一致。说明本研究采用RB-PDA平板显色法筛选具有漆酶活性的融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A具有良好的遗传稳定性。实验室出菇试验结果显示,融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A的生物学效率明显高于亲本斑玉蕈而生产周期与斑玉蕈相比有一定的缩短。关于融合菌株的生物学特性及生产性能还有待于做进一步的深入研究。3结论和讨论3.1原生质体的融合菌株的筛选目前融合菌株的筛选多采用抗药性标记、营养缺陷型标记、形态差异观察(邹莉等2006)、锁状联合(孙丽等1999)、次生代谢产物抗性(陈家任等1998)、荧光色素标记(熊杰等2006)及灭活原生质体(王澄澈和梁枝荣2000)等方法。每种筛选方法都有其各自的优缺点,但这些原生质体融合菌株的筛选方法只能确定融合菌株具有活性,关于融合菌株的遗传信息及是否具有生产应用价值,最终只能通过出菇试验来证明,操作起来比较繁琐,工作量大,亲本的优良性状易受到影响甚至丢失(曾荣等1995)。本研究根据出发菌株凤尾菇与斑玉蕈漆酶活性的差异,建立不同菌株间的漆酶转化体系,采用RB-PDA平板显色技术与原生质体灭活相结合的方法能快速、高效地筛选出具有漆酶活性的融合菌株,目标明确、操作简便、结果直观、一目了然。此种筛选方法相对于传统筛选方法具有显著优越性,在食用菌育种中具有广阔的应用前景。3.2其他方面的研究漆酶具有广泛的作用底物,可以氧化降解酚类化合物及其衍生物(Yaropolovetal.1994),也可以氧化降解一些不含酚羟基的酚类类似物及木质素(Bourbonnais&Paice1990),对漆酶应用的研究多见于改善油漆的性能,处理含有酚类物质的污水,改进造纸工艺,进行环境监测,酶法合成化合物等(Thurston1994)。关于漆酶在食用菌栽培生产中的研究报道极少,Zhao&Kwan(1999)报道了漆