植物乳杆菌对炎症性肠病肠道菌群紊乱的影响

植物乳杆菌对炎症性肠病肠道菌群紊乱的影响

感染性肠病（ibd）主要包括溃疡性肠病（iuc）和克罗恩病（cd）。病因不明，目前缺乏有效的治疗方法。IBD的发生和发展与肠道菌群有着密切的关系,IBD患者表现出明显的肠道菌群紊乱。益生菌(Probiotics)因其对其他细菌具有明显的调节作用和较少毒副作用而逐渐成为IBD治疗的新手段,也成为目前研究的热点,但目前尚缺乏有关益生菌对IBD肠道菌群紊乱调节作用的研究。本研究将采用可自发形成类似于人CD病的白介素10基因敲除(IL-10-/-)小鼠作为IBD模型,研究植物乳杆菌CGMCC125S(LactobacillusplantarumCGMCC125,LP)对IBD肠道菌群紊乱及细菌移位的影响。1材料和方法1.1白介素10基因缺失小鼠和空白对照小体小鼠il-10-/-LP由上海交大昂立医药研究院提供。该菌最初从婴儿粪便中分离纯化而来,具有良好的益生菌特性。LP以低压冻干菌粉的形式保存于-20℃以下。菌粉用Ringer缓冲液稀释后2h内经改良MC培养基37℃厌氧培养48h,活菌数达5×1010CFU/g。129品系白介素10基因敲除(IL-10-/-)小鼠及空白对照组小鼠均购自美国Jacksonlaboratories公司。本实验所使用的小鼠均为8周龄雌性小鼠,并以IL-10-/-小鼠作为IBD模型。动物使用许可证号:SYXK(沪)2008-0050。1.2厌氧培养基aRinger缓冲液、TPY基础培养基和改良MC培养基(上海市疾控中心);N-N琼脂培养基、MacConkey平板和血琼脂培养平板(伊华公司);胰化大豆琼脂(TSA)培养基(环凯生物科技有限公司);厌氧罐和厌氧产气袋(生物梅里埃公司);MicroscanAutoscan-4细菌鉴定系统和RA-ID板(DadeBehring公司)、SW-CJ超净工作台(苏州净化设备有限公司)、DNP-9028恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、TMQR-3250压力蒸汽灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)、HHS型恒温水浴锅(上海博讯有限公司)、VM-10漩涡振荡器(上海精科实业有限公司)、Scientz无菌均质器(宁波新芝生物科技有限公司)等。1.3方法1.3.1检测linger缓冲液、分光光度法LP菌株于MRS液体培养基中37℃厌氧培养12h,5000r/min离心5min后除去上清液,菌体重悬于无菌Ringer缓冲液中,利用分光光度法配制成1.0×109CFU/mL浓度的LP悬液。1.3.2l-10-/-+lp组将8周龄雌性小鼠随机分成空白对照组、IL-10-/-组和IL-10-/-+LP组,每组5只。IL-10-/-+LP组每日0.5mLLP菌液(1.0×109CFU/mL)灌胃,其余两组Ringer缓冲液0.5mL灌胃,持续4周。于实验开始后第0、2、4周收集小鼠粪便样本,检测肠道菌群变化,并于实验结束后无菌收集小鼠肠系膜淋巴结和脾脏进行细菌移位检测。1.3.3培养基ld50①Ringer缓冲液:含有半胱氨酸0.25g的Ringer1片(Oxoid),蒸馏水500mL,121℃15min。②MRS液体培养基:蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母粉5g,K2HPO42g,柠檬酸二铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,吐温801mL,MgSO4.7H2O0.58g,MnSO4.4H200.25g,蒸馏水1000mL,pH6.4。121℃,灭菌15min。③TPY培养基:TPY琼脂粉末39g,番茄汁400m(自制),蒸馏水600mL,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)0.1g,121℃15min,冷却至45℃。④改良MC培养基:改良MC琼脂粉77g,蒸馏水1000mL,吐温801mL,121℃15min。冷却至45℃,加入添加剂磷霉素(15.9mg/mL)、磺胺甲氧甲嘧啶(18.6mg/mL)、三甲氧卞氨嘧啶(1mg/mL)各5mL。⑤N-N琼脂培养基:BactoPetone40g(Difco),Na2HPO45g,Ka2HPO41g,NaCl2g,MgSO40.1g,葡萄糖2g,Bacto琼脂25g(Difco),蒸馏水1000mL,pH7.6,115℃15min。冷却至45℃,加蛋黄EggYolkEmulsion100mL(Oxoid)和硫酸新霉素(50mg/mL)4mL。⑥胰化大豆琼脂培养基(TSA):TSA琼脂粉末48g,蒸馏水1000mL,pH7.3,121℃15min。1.3.4培养基及微生物培养在无菌条件下收集新鲜小鼠粪便约0.1g,置于4℃Ringer缓冲液中,并在2h内将标本运送至微生物操作室。将标本震荡混匀后系列稀释10倍,分别取其适宜稀释度悬液涂布于TPY培养基(双歧杆菌)、改良MC(乳酸菌)、N-N培养基(产气荚膜梭菌)MacConkey培养基(肠杆菌)。除MacConkey培养基37℃、需氧培养24h外,其余各培养基均需37℃、厌氧培养48h。各培养基中细菌菌落需根据菌落特征、革兰氏染色和镜检初步鉴定后方可计数,并转换成每克粪便中细菌含量,单位以log,o(CFU/g)表示。无菌采集肠系膜淋巴结及脾脏,匀浆后系列稀释10倍分别涂布于血琼脂培养基和胰化大豆琼脂培养基,在厌氧和需氧条件下37℃培养72h。两者计数之和作为肠道细菌移位数量,结果为每克组织中的细菌含量,单位log10(CFU/g)。1.4统计学处理方法采用SPSS13.0软件包进行统计,实验数据以表示,统计方法采用单因素方差分析(One-wayANOVA),组间比较采用SNK法。P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1菌株鉴定及鉴定①双歧杆菌:挑取TPY培养基蓝色可疑菌落,在相差显微镜下活体观察。形态为多形型,菌体呈直、弯、分叉、球拍状或棒状(X、V、Y型等),革兰染色为阳性杆菌。对可疑菌落采用MicroscanAutoscan-4系统和RA-ID板进一步鉴定(图1)。②乳酸杆菌:挑取改良MC培养基上灰白色中等大小的可疑菌落,在相差显微镜下活体观察,菌体呈杆状、短链状或栅状,革兰染色为阳性杆菌。③产气荚膜梭菌:在N-N琼脂培养基上菌落周围因为卵磷脂酶分解卵磷脂而出现乳白色浑浊圈。本菌为革兰阳性粗大杆菌,芽孢位于菌体中央或次极端。④肠杆菌:MacConkey平板上生长,菌落湿润,中等大小,革兰染色为阴性杆菌。2.2lc对大鼠肠道菌群的调节作用2.2.1灌胃lp菌液2周后双歧杆菌含量的变化IL-10-/-组小鼠与空白对照组相比肠道双歧杆菌含量明显下降(P<0.05)。IL-10-/-+LP组灌胃LP菌液2周后双歧杆菌含量上升,但与IL-10-/-组比较差异无统计学意义(P>0.05);灌胃LP菌液4周后双歧杆菌含量较IL-10-/-组明显增加(P<0.05),但与空白对照组相比并未恢复至正常水平(P>0.05)(图2A)。2.2.2il-10-/-+lp对乳酸杆菌含量的影响IL-10-/-组小鼠在干预前肠内乳酸杆菌含量明显下降。IL-10-/-+LP组灌胃LP菌液2周后乳酸杆菌的含量明显增加(P<0.05),干预4周后乳酸杆菌含量与空白对照组相比已无统计学差异(P>0.05)(图2B)。2.2.3il-10-/-+lp对产气荚膜梭菌和肠杆菌的影响在实验开始时产气荚膜梭菌和肠杆菌在IL-10-/-组小鼠肠内含量已明显高于空白对照组(P<0.05),IL-10-/-+LP组灌胃LP菌液2周后尽管并未明显降低肠杆菌含量,但产气荚膜梭菌含量则明显低于IL-1O-/-组(P<0.05),干预4周后产气荚膜梭菌和肠杆菌的含量均明显升高,但并未恢复至正常水平(P<0.05)(图3A、B)。2.3系膜淋巴结和脏器中的位移细菌实验结束后对照组小鼠并未检测到肠系膜淋巴结和脾脏细菌移位,而IL-10-/-组小鼠肠系膜淋巴结和脾脏中的移位细菌数量明显高于空白对照组(P<0.05)。经连续4周LP灌胃后,IL-10-/-+LP组小鼠肠系膜淋巴结和脾脏移位细菌的数量明显低于IL-10-/-组(P<0.05),但与空白对照组相比仍有统计学差异(P<0.05)(表1)。3lp治疗粗隆间肠道菌群的作用机制肠道微生态对维持机体健康状态的作用越来越受到人们的关注,甚至有作者将其称为“被遗忘的器官”。目前已知,肠道微生态失衡与诸多疾病的发生和发展存在密切的相关性,如肥胖、糖尿病、非酒精性肝病和癌症等,IBD亦位于其列。大量临床实验研究亦证实,IBD患者存在不同程度的肠道菌群失调。IBD是一种慢性、复发性自身免疫性疾病,病因未明,目前普遍认为是遗传、免疫和环境因素综合作用的结果。对IBD的治疗尚缺乏有效的手段,目前仍无法治愈,但抗生素治疗能明显减轻肠道炎症。一些可自发形成肠炎的实验动物模型如IL-10-/-小鼠、IL-2-/-小鼠等,在无菌条件下并不发生肠道炎症,这些事实都表明肠道菌群在IBD的发生和发展中起到了至关重要的作用。近年来,大量的临床和实验研究进一步提示,IBD患者肠内菌群调节将成为IBD治疗的新靶向。益生菌被定义为活的、非致病性的微生物,当摄入足够量时可对机体产生除营养以外的更多有益作用。益生菌可通过多种途径,比如对肠道菌群的调节作用来发挥其对机体健康的有益作用,由此益生菌亦可作为调节肠道菌群的一种手段来治疗与菌群失调有关的诸多疾病,包括IBD。已有研究表明,植物乳杆菌能通过调节机体免疫反应来减轻IL-10-/-小鼠肠道炎症,但对如何调节肠道菌群尚不清楚。本实验主要研究LP对已建立肠炎的IBD小鼠肠道菌群的调节作用及细菌移位的影响。在本实验条件下,IL-10-/-小鼠8周龄即已出现明显的肠道炎症,这同Madsen等的研究结果一致。亦有报道肠道菌群的组成具有性别差异,故采用8周龄雌性小鼠作为研究对象。本实验结果证实,LP能顺利通过肠道,耐受体内的酸碱等复杂环境,具有明显的益生菌特性,且具有较好的肠道内定植能力。益生菌发挥其有益作用的确切机制尚不清楚,而且不同菌株具有不同的作用机制。益生菌的作用机制主要包括:对潜在致病菌的竞争性抑制;调节机体局部和系统免疫反应;增强肠道屏障功能等。既往实验研究表明,益生菌具有调节肠道菌群的能力。本实验研究结果显示,IL-10-/-小鼠8周龄时即已出现肠道菌群紊乱,被称为“有益菌”的肠道双歧杆菌和乳酸杆菌含量出现了明显的下降,而潜在的“有害菌”(肠杆菌和产气荚膜梭菌)含量则出现了显著的升高,这与IBD患者肠内细菌检测结果相一致。经连续4周LP治疗后,IL-10-/-+LP组小鼠肠道双