一种新型罗丹明b衍生物的合成及性质研究

一种新型罗丹明b衍生物的合成及性质研究

罗丹明衍生物荧光探针罗丹明作为一个荧光标记，在分析和酶化学等领域得到了广泛应用。通过引入不同官能团对罗丹明母体骨架进行结构设计改造,以改善其性能,扩展应用。基于罗丹明荧光基团而设计的金属离子荧光探针大多是通过罗丹明酰化合成,该类化合物具有形成“OFF-ON”型荧光探针的潜能。本课题组报道了系列杯芳烃、三角架及小分子结构的罗丹明衍生物荧光探针的研究。不同修饰方式得到的不同结构罗丹明衍生物,能选择性响应多种金属离子,识别性能存在差异。文献报道了Fe3+离子荧光猝灭及荧光增强型罗丹明类探针。设计合成并筛选出对金属离子高灵敏识别、高选择性响应、分析性能优越的小分子罗丹明类荧光探针仍具有研究价值。本文合成了一种新型罗丹明内酰胺席夫碱衍生物并研究了该衍生物对Fe3+的响应及应用分析性能。1实验部分1.1仪器和试剂参照文献仪器。牛血清蛋白(BSA,SolarbioCompany),其余参照文献试剂。1.2罗丹明席夫碱的表征参照文献方法,以罗丹明B与二乙烯三胺生成罗丹明内酰胺,再与苯基乙酰丙酮缩合得到罗丹明席夫碱(1),目标化合物结构经1HNMR,13CNMR,MS以及元素分析表征,结构式图如Scheme1所示。1.3荧光光谱测定1.00×10-4mol·L-1罗丹明席夫碱乙醇溶液;2.00×10-3mol·L-1Fe3+及其他金属离子乙醇溶液;4.0×10-3mol·L-1Tris-HCl乙醇-水缓冲溶液。移取适量罗丹明席夫碱(0～8.0mL),Tris-HCl溶液(1.0mL),Fe3+或其他金属离子溶液(0～8.0mL),乙醇-水溶液(3∶1,V∶V)稀释至10mL。荧光光谱测定的激发和发射波长为556/578nm。以Tris-HCl缓冲溶液(pH6.0,含0.1mol·L-1NaCl维持溶液离子强度)为溶剂配制1.0×10-4g·mL-1的BSA标准溶液备用。BSA标准液在0～4℃冰箱中保存。2结果与讨论2.1金属离子检测衍生物的性质与介质的酸度有很大关系。我们选择pH6.0的乙醇-水(3∶1,V∶V)为最佳实验条件,该条件下罗丹明席夫碱在556nm激发波长下无明显的荧光发射并且在可见光区无吸收。而Fe3+的加入使罗丹明席夫碱溶液的荧光显著增强,由无色变为红色。其他常见实验金属离子的加入均无明显的响应信号(除Cu2+有微弱的响应外),实验表明该罗丹明席夫碱可作为检测Fe3+的高选择性探针(图1)。用摩尔比和Job法分别进行了Fe3+对罗丹明席夫碱的荧光及吸收滴定实验(图2),推测出Fe3+和罗丹明席夫碱形成为1∶1的配合物。荧光和吸收法分别计算得Fe3+与罗丹明席夫碱的相互作用稳定常数分别为1.51×104和2.80×104L·mol-1。并根据文献方法测定了配合物的荧光量子产率(Ф)为0.70。常见共存金属离子的干扰实验结果表明除Cu2+外(相对于Fe3+浓度1.5倍),在Fe3+-罗丹明席夫碱溶液中加入相对于Fe3+浓度2.5倍的其他大部分常见金属离子时,均不会对Fe3+诱导罗丹明席夫碱的荧光及紫外响应产生影响。表明该罗丹明席夫碱可作为检测Fe3+的高灵敏度探针。2.2配合作用的鉴定用HPLC方法分别对罗丹明席夫碱及Fe3+-罗丹明席夫碱配合物溶液的色谱进行了分析。在保留值为8.4min处出现罗丹明席夫碱色谱峰。而在罗丹明席夫碱中加入Fe3+的混合溶液,一个新的色谱峰出现在保留值为6.4min处,原来的罗丹明席夫碱色谱峰仍然存在且强度明显减弱,表明出现了新的配合物。罗丹明席夫碱及Fe3+配合物混合乙醇溶液的IR光谱测定见图3。加入Fe3+前后罗丹明席夫碱在1681cm-1处的羰基特征峰变化显著,CN峰(1615cm-1)强度明显减弱,我们推断羰基和CN参与了配合作用。罗丹明席夫碱及其Fe3+配合物的1HNMR核磁谱如图4所示,在罗丹明席夫碱中加入Fe3+后,峰形明显变宽,罗丹明结构部分的质子大多向低场移动(δ=0.06～0.41ppm),例如Hp,Ha,Hc,Hb,Hd,Hf,He,Hg(δ=0.16,0.32,0.34,0.41,0.12,0.11,0.19,0.06ppm),这是由于罗丹明生成了醌式结构,导致电子云密度降低。实验结果与文献类似。以EDTA为配合竞争试剂,在Fe3+-罗丹明席夫碱配合物溶液中加入相对于罗丹明席夫碱80倍的EDTA,发现溶液立即褪色,荧光淬灭;当再加入100倍的Fe3+(相对于罗丹明席夫碱)后,溶液颜色、荧光及吸收强度均恢复接近未加竞争试剂前,此过程证明了配合反应的可逆性。从以上实验结果我们推测出配合作用的机理如Scheme2所示。由于配合物的形成,诱导探针的螺环结构打开,发生荧光及吸收显著变化,这与文献报道的罗丹明类探针响应金属离子的离子诱导作用相同。2.3检出限和定量限测试表明,Fe3+浓度在0.4～20×10-6mol·L-1(R=0.9914,n=8)和2.0～8.0×10-5mol·L-1(R=0.9967,n=11)间,溶液荧光强度与Fe3+浓度呈线性相关,计算得检出限为4.24×10-8mol·L-1;以556nm为最大吸收波长测定紫外吸收,Fe3+响应的浓度在0.4～80×10-6mol·L-1(R=0.9968,n=17)范围内,检出限为2.01×10-7mol·L-1。在上述最佳实验条件下,对自制含铁样品溶液进行了检测,其结果如表1所示,具有良好的回收率和较低的相对标准偏差。2.4配合物与bsa的结合常数研究蛋白质与配体之间的相互作用及动力学过程,对解释蛋白质结构与功能的关系及蛋白质与各种配体的作用机制意义重大。利用小分子配体与生物大分子结合前后的光谱差异,在不分离的情况下用分子光谱研究配体与蛋白质分子的相互作用。分别以罗丹明席夫碱及Fe3+-罗丹明席夫碱配合物为探针,研究了与牛血清蛋白(BSA)作用的荧光光谱特征。发现单纯的配体与BSA作用的光谱强度变化灵敏度远远小于配合物的作用,初步建立了利用金属配合物作为探针研究测定痕量蛋白质的方法。在室温下配合物能迅速与蛋白质结合形成复合物,并可稳定5h,其荧光强度基本保持不变。在一定的BSA浓度范围内,随BSA浓度的增大,Fe3+-罗丹明席夫碱配合物的荧光强度逐渐降低,并具有良好的线性关系,线性范围为1.0～10μg·mL-1,检出限可达3.78×10-2μg·mL-1。随着温度的升高,猝灭曲线斜率降低,初步证明该过程为静态猝灭。其荧光强度变化用静态猝灭公式求得不同温度下的KA和n,结果见表2。数据显示,Fe3+-罗丹明席夫碱配合物与BSA的结合常数较大,且温度对结合常数KA影响很小。较大的KA数值说明Fe3+-罗丹明席夫碱配合物与BSA之间有较强的结合作用,可以被蛋白质运输和储存。有机小分子和蛋白质之间的作用力主要有疏水作用力、氢键、范德华力和静电引力等。不同分子与蛋白质结合力的类型不同。由表2中数据:ΔH<0,ΔS>0,说明配合物与BSA之间的主要作用力为静电引力,且ΔG<0,所以配合物与BSA之间的结合反应是自发进行的,可以作为研究BSA的标记试剂。3与fe3+及罗丹明席夫碱配合物的催化剂的区别合成了一种新型罗丹明