几种水溶性金属席夫碱与dna相互作用的光谱研究

几种水溶性金属席夫碱与dna相互作用的光谱研究

近年来，一些小分子与dna的相互作用，以及有机金属配合物与dna或断裂的dna分子引起了许多研究人员的注意。一些金属络合物如:Cu-phenanthroline、Fe-EDTA、Mn-porphrin、Ru-polypyridyl及金属席夫碱,在氧化剂存在的条件下,能够断裂或者键合DNA。席夫碱及金属席夫碱化合物是一类抗癌药物,但其与DNA的相互作用机理较少报道。研究抗癌药物与DNA的相互作用机理,对选择核酸酶及抗癌药物的合成具有重要意义。本文报道了几种水溶性的金属席夫碱与小牛胸腺(CT)DNA的相互作用。在生理条件下,用荧光光谱研究了它们与CTDNA作用的强弱。紫外可见光谱,KI猝灭效应,金属席夫碱、溴化3,8＿二氨基＿5＿乙基＿6＿苯基菲啶(EB)与DNA的竞争键合都证实了金属席夫碱与DNA的相互作用方式为嵌入作用方式。Mn合4＿三乙胺甲基水杨醛亚胺作为一种新型荧光探针,可用于DNA的分析测定。1实验部分1.1仪器、u3000测定Hitachi850荧光分光光度计(日本),pHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂),WFZ-34A紫外可见分光光度计(天津仪器厂)。CTDNA,华美生物工程公司产品,UV测定A260/A280大于1.8,配制成2g/LCTDNA的NaCl水溶液保存于4℃冰箱中。水溶性金属席夫碱按文献合成,结构见图1。产物的熔点及元素分析结果均与文献报道值相符。实验用水为一次蒸馏水,其余所用试剂均为分析纯。1.2实验方法1.2.1金属席夫碱分光光度法检测10mL比色管中加入100μL1.0×10-3mol/L的金属席夫碱溶液,用pH=7的Britton-Robison(BR)缓冲液稀释至刻度,取3mL于比色皿中,加入不同量的CTDNA,以相应空白作溶液参比,在紫外可见分光光度计上扫描其吸收光谱。2结果与讨论2.1金属席夫碱与dna的相互作用分别取相同浓度的金属席夫碱溶液测定它们的荧光强度,当发射波长为410nm时,在236nm和303nm左右出现2个激发峰,不同金属化合物在410nm左右荧光峰的强度不同,其中Ni化合物的荧光强度最强,Mn次之,Cu最弱。在它们的溶液中加入相同量的DNA溶液,观察到3种物质(金属席夫碱浓度为1.0×10-5mol/L)的荧光强度均降低,而Mn的荧光强度降得最显著(见表1),这表明Mn席夫碱与DNA的相互作用最强,这可能是由于Mn原子d轨道中具有较多的未配对电子,因而本文以Mn化合物(化合物1)为研究对象来讨论水溶性的金属席夫碱与DNA的相互作用。化合物1的荧光强度随着DNA的加入,逐渐降低,其猝灭常量(Ksv)可用Stern-Volmer方程来描述:式中F0和F是DNA不存在和有DNA存在时的荧光强度,Ksv是Stern-Volmer猝灭常量,用来衡量DNA猝灭速率,c为DNA的浓度。由CTDNA浓度与化合物1的荧光强度关系曲线(图2)可知,Stern-Volmer猝灭常量为1.4×104L·mol-1,很明显在很高浓度下的DNA其猝灭作用仍没有达到饱和,这显示仅有一部分键位对荧光有猝灭作用,同时它的相对荧光强度与DNA的浓度在3×10-6～2×10-4mol/L之间呈线性关系。2.2吸收光谱的减色效应化合物1的紫外-可见光谱如图3所示,由图3可见对于化合物1,随着DNA的加入,其吸收光谱发生明显的减色效应,同时其234nm处的吸收峰有2nm的微小紫移。可能是因为化合物1的π-π*键与DNA的静电基团发生重叠,使UV吸收光谱发生改变,表明化合物1可能已嵌入DNA的碱基对中。2.3变性dna的制备将天然的DNA(dsDNA)在100℃的水浴中加热15min,然后放入冰浴中迅速冷却,再回复至室温,即可得到变性DNA(ssDNA)。天然DNA变性后,其紧密堆积的两条链松散开来,成为两条单链。在同浓度的化合物1溶液中分别加入不同量的ssDNA和dsDNA,记录它们各自的荧光值(见图4)。由图4可知变性DNA和天然DNA都对化合物1的荧光有猝灭作用,只是强度不同,变性的DNA对化合物1的荧光猝灭作用减弱了。2.4ph值对化合物1-dna体系的影响以不同pH值的BR缓冲液配制相同浓度的化合物1溶液,分别记录它们在有DNA和没有DNA存在的荧光强度。实验表明在pH=4～8的范围内,溶液pH值的改变对化合物1的荧光强度的影响较小,而当pH<4或pH>8时,pH值的影响较大,但pH值的变化在整个pH范围内对化合物1-DNA体系的影响都较小。可能因为在低pH值的酸性条件下化合物1质子化,而在高pH值的碱性条件下,化合物1的Mn2+与OH-配位,破坏了化合物1的结构,从而使其荧光强度发生较大的变化。但在有DNA存在时,由于化合物1嵌入DNA双链中受到磷酸骨架的保护,受外界离子的影响变小,所以pH值的改变对它影响较小。2.5符合ki的高效点一些物质(如卤素离子、硝基化合物、重金属离子等等)可以使荧光猝灭。KI是常用的荧光猝灭剂,荧光猝灭实验可用Stern-Volmer方程来描述,猝灭常量Ksv用来衡量KI的猝灭速率。本实验通过在有CTDNA存在和无CTDNA存在的情况下,KI对化合物1的荧光猝灭程度不同,进一步论证化合物1与DNA的嵌入作用。图5是KI的猝灭实验曲线,由图5可知化合物1的荧光强度随KI的增加而快速降低,没有DNA存在时比有DNA存在时降得快,它们的猝灭常量(Ksv)分别为94L·mol-1和61L·mol-1。这表明化合物1嵌入DNA双链中,因受到磷酸基团的保护从而使荧光猝灭变慢。2.6化合物与eb-dna的反应的计算EB是一种具有平面结构、能与DNA双链发生嵌入作用的荧光染料,它能插入到DNA双链的碱基对之间导致其荧光强度大大增强,如果化合物与DNA发生类似的作用,就会竞争其结合位点,减弱EB-DNA体系的荧光,通常以c(comp1)/c(DNA)<100为限,荧光值减弱50%作为化合物是否与DNA作用的判据。由图6可知随化合物1浓度的增加EB-DNA荧光强度减弱,当化合物1的浓度增至c(comp1)/c(DNA)=31.84时,体系的荧光强度已降至48.5%,这表明化合物1嵌入到了DNA双链之间。2.7不同温度对物1-dna体系荧光强度的影响温度对物质的荧光强度有一定影响一般来说温度越高荧光强度越低对化合物而言随温度的升高荧光强度降低,但在化合物1-DNA体系中,随温度上升,体系荧光强度先升后降(图7)。在较低温度下,DNA双链堆积较为紧密,化合物1嵌入碱基对中,因而荧光强度较弱,随着温度升高,DNA双链的堆积程度减弱,荧光强度增强。但当温度升至近60℃时,DNA双链几乎完全松散,变性DNA对化合物1的荧光猝灭保护作用减弱,因而该体系的荧光强度又降低。3嵌入作用模式与ctcda的关系金属离子对金属席夫碱荧光光谱的影响较小,Mn席夫碱以嵌入作用模式与CTDNA有较强