小柴胡汤小分子成分指纹图谱研究

小柴胡汤小分子成分指纹图谱研究

小柴胡汤是东汉张仲景“伤寒论”所著的一种经典方剂，被称为少阳调理剂。柴胡、黄甘草、生姜和枣的质量比为24。9:099:9.14（枚）。它具有和少阳调和的功效。主要用于“寒热交替、胸闷腹胀、饮食时差、兴奋、呕吐”。它在所有临床上都取得了显著的成就，并受到历代医家的高度赞扬。现代研究表明,小柴胡汤能够调节细胞免疫、诱生多种细胞因子,具有解热、抗菌、抗炎、抗病毒和保肝等多种作用。目前对以小柴胡汤配方为基础中成药制剂的质量控制方法多采用薄层扫描法、高效液相色谱法(HPLC)等,控制的指标性成分多为黄芩苷,也有测定柴胡皂苷类成分含量的文献报道。2005版《中国药典》采用HPLC-紫外检测法,按小柴胡片计,每片含黄芩以黄芩苷计(C21H18O11)不得少于2.0mg,2010版《中国药典》继续沿用该方法。由于小柴胡汤中还含有很多其他药效成分,如皂苷类化合物和黄酮类化合物,因此现有的仅以黄芩苷含量来表征的小柴胡汤质量控制方法并不能很好地控制其质量。本研究旨在以小柴胡汤为研究对象,建立全面表征传统方剂化学成分的技术和方法,同时,将来作为颗粒剂质量控制方法的一个组成部分,最终目标是研制出新的既符合中医用药规律和中药方剂特点又有现代质量控制和生产工艺的小柴胡方颗粒制剂。1材料和方法1.1测试剂纯净水;乙腈和甲醇均为色谱纯;其余试剂为分析纯。小柴胡汤的单味药材均购自北京三和药业有限公司。1.2在线质谱组成Agilent1100高效液相色谱仪,配有AgilentG1314AVWD检测器,二元泵,自动进样器;QSTAR四级杆飞行时间串联质谱系统(AppliedBiosystem/MDSSciex);KQ2200E型超声清洗器,昆山市超声仪器有限公司;Sartorius-BS124S电子天平,北京赛多利斯天平有限公司。1.3试验溶液的制备1.3.1小柴胡汤小分子成分的提取按小柴胡汤方配比称取单味药,加入10倍量蒸馏水回流提取2次,每次2h,过滤,合并两次滤液。将滤液浓缩至1ml药液相当于6g生药,加入适量95%乙醇,至溶液中乙醇含量为70%,均匀搅拌,静置过夜,离心(25min,1180×g),用70%乙醇洗涤沉淀,离心(25min,1180×g),合并上清,浓缩除醇,将得到的提取物70℃真空干燥,得到小柴胡汤小分子成分样品。精密称取上述样品0.1000g,用50%色谱纯甲醇定容至10ml,0.45μm微孔滤膜过滤,得到小柴胡汤供试品溶液,进行HPLC分析。1.3.2单味中药样品溶液的制备分别取柴胡、黄芩、人参、制半夏、炙甘草、生姜和大枣,按上述条件制成单味药材供试品溶液。1.4色谱条件及色谱柱色谱柱为ThermoScientificSyncronisC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以乙腈-水(含0.1%甲酸)为流动相梯度洗脱(见表1),流速1.0ml/min,检测波长276nm,进样量20μl。1.5喷射电压及动态背景约束离子源为ESI源;扫描方式为一级全扫描,正、负离子分别采集数据,数据采集速度为5Hz;扫描质量范围为100～1000;正、负离子扫描模式下的喷射电压分别为4500V和-4500V;源温为450℃;雾化气为60;加热辅助气为65;卷帘气为35;动态背景扣除(DBS)开启。数据采集和处理采用AnalystQS2.0数据处理系统,梯度洗脱程序同1.4。2结果2.1小柴胡汤指纹图的构建与资源峰的识别2.1.1小柴胡汤样品溶液的指纹图采用1.4所述条件,得到小柴胡汤供试品溶液的指纹图谱(图1),主要色谱峰得到良好的分离,共标记了19个特征色谱峰。2.1.2指纹图谱的筛选为进一步阐明小柴胡汤的化学组成,根据色谱峰的保留时间和峰面积进行定性和定量分析,采用Q-TOF-MS-IDA-MS/MS技术并结合文献,对HPLC指纹图谱19个特征色谱峰中的11个色谱峰进行了推测,结果见表2,其中,芒柄花苷、柴胡皂苷A、黄芩黄酮Ⅱ等为以往该方指纹图谱中所没有表征的成分。2.1.3色谱峰的可能来源将小柴胡汤供试液HPLC图分别与其组方中各单味药(生姜、人参、炙甘草、大枣、柴胡、半夏、黄芩)供试液HPLC图相比较(图2和图3),通过比对各色谱峰的保留时间,对各个色谱峰的可能来源进行归属,结果表明,峰1来自柴胡、大枣、甘草、黄芩、人参和生姜;峰2来自半夏、大枣、黄芩、人参和生姜;峰3来自甘草和黄芩;峰6、8～13、15、19均来自黄芩;峰14、18来自黄芩和生姜;峰17来自所有的7味单药。2.2方法研究2.2.1相对保留时间和相对峰面积取1.3.1项下同一供试品溶液按1.4项下条件连续测定6次,考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果相对保留时间的RSD<0.3%,相对峰面积RSD<7.0%,表明仪器稳定,精密度良好。2.2.2指纹图谱的测定取1.3.1项下同一供试品溶液按1.4项下条件,分别在0、2、4、6、12和24h测定其指纹图谱,考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果相对保留时间的RSD<0.4%,相对峰面积RSD<7.0%,表明供试品溶液在24h内基本稳定。2.5.3相对保留时间和相对峰面积按1.3.1项下供试品溶液制备方法平行处理样品6份,按1.4项下条件分别测定,考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果相对保留时间的RSD<0.3%,相对峰面积RSD<9.0%,表明该方法重复性良好。3指纹图谱的建立要根据样品特性所反映的整体特性,对于我们发现了大量选择指纹图谱时指纹图谱的种类和指纹图谱设计的内容,有利于探索中药所含含量指纹图谱的种类与数量指纹图谱的前处理条件,及时掌握样品所含含量指纹图谱的种类和数量指纹图谱的潜在成分本实验中,我们在样品小柴胡汤的前处理过程中,仅选用水提醇沉处理,最大限度地保留了样品中小分子成分,这样得到的色谱图能够比较全面地反映出样品的整体特性,如在特征指纹峰结构鉴定中,我们推测出了11个特征色谱峰成分,其中芒柄花苷、柴胡皂苷A和黄芩黄